Apresentamos um método para avaliar a expressão de microRNA no rim e soro de camundongos com comprometimento renal dependente da idade por reação quantitativa em cadeia de polimerase de transcrição reversa.
MicroRNAs (miRNAs) são RNAs pequenas e não codificantes que consistem em 21-25 bases. Eles não são traduzidos em proteínas, mas trabalham para impedir o funcionamento de seus RNAs (mRNAs) mensageiros-alvo, desestabilizando-os e interrompendo sua tradução. Embora os perfis de expressão do miRNA em vários órgãos e tecidos do camundongo tenham sido investigados, não houve métodos padrão para purificar e quantificar os miRNAs renais e soros. Estabelecemos um método eficaz e confiável para extrair e avaliar a expressão miRNA no soro e rim de camundongos com comprometimento renal dependente da idade.
O método utiliza reação quantitativa de cadeia de transcrição reversa-polimerase (qRT-PCR), e o protocolo requer seis etapas: (1) preparar ratos de resistência acelerada do rato 1 (SAMR1) e camundongos propensos a camundongos com resistência acelerada de senescência (SAMP1); (2) extração de amostras de soro desses camundongos; (3) extração de uma amostra de rim de cada camundongo; (4) extração total de RNA (incluindo miRNA) de amostras de rim e soro de cada rato; (5) a síntese do DNA complementar (cDNA) com transcrição reversa do miRNA; (6) condução de um qRT-PCR utilizando o cDNA obtido.
Este protocolo foi usado para confirmar que, em comparação com os controles, a expressão de miRNA-7218-5p e miRNA-7219-5p foi significativamente alterada no rim e soro de um modelo de camundongo de comprometimento renal dependente da idade. Este protocolo também esclareceu a relação entre o rim e o soro do modelo de camundongos de comprometimento renal dependente da idade. Este protocolo pode ser usado para determinar a expressão miRNA no rim e soro de camundongos com comprometimento renal dependente da idade.
A expressão de vários mRNAs que desempenham papéis importantes tanto na fisiologia quanto na doença (por exemplo, inflamação, fibrose, distúrbios metabólicos e câncer) é conhecida por ser regulada por miRNAs, que são RNAs curtas e não codificadoras que causam a degradação e inibem a transcrição do mRNA1. É possível, portanto, que certos miRNAs possam servir como novos biomarcadores candidatos e/ou metas terapêuticas para diversas doenças 2,3,4,5. Pesquisas têm sido conduzidas em perfis de expressão miRNA em uma variedade de órgãos e tecidos de camundongos (incluindo cérebro6, coração7, pulmão8, fígado9 e rim10). No entanto, não existem métodos padrão ou estabelecidos para extrair e avaliar miRNAs nos rins ou soro de camundongos com comprometimento renal dependente da idade.
Por isso, estabelecemos um protocolo que pode ser usado para purificar e detectar de forma confiável a expressão de miRNA no soro e rim de camundongos com comprometimento renal dependente da idade. Há seis etapas principais no protocolo: (1) preparação de ratos machos SAMR1 de 50 semanas de idade e camundongos machos SAMP1; (2) extração de amostras de sangue da veia cava inferior de ambas as cepas de camundongos, com o uso subsequente de um tubo de espia com heparina, seguido de centrifugação, para obtenção de uma amostra de soro; (3) a extração da amostra de rim do homogeneizador de silício é usada para homogeneizar a amostra renal separadamente, e a amostra é então transferida para um sistema de trituração de biopolímeros em uma coluna de spin de microcentrifuuge11; (4) extração total de RNA (contendo miRNA) das amostras de soro com o uso de uma coluna de spin baseada em membrana de sílica12 e RNA total contendo extração de miRNA das amostras renais com o uso de uma coluna de spin baseada em membrana de sílica11; (5) síntese de DNA complementar (cDNA) do RNA total utilizando transcriptase reversa, polimerase poli(A) e primer oligo-dT13,14; e (6) finalmente, determinação da expressão miRNA usando qRT-PCR e um corante intercalante13,14.
Este novo protocolo foi baseado em estudos que conseguiram extrair e avaliar miRNAs em vários tipos de tecido 11,12,13. O sistema de trituração de biopolímeros do protocolo foi demonstrado para ser capaz de purificar o RNA total de alta qualidade dos tecidos11. A precisão e sensibilidade dos aspectos deste protocolo utilizados para a avaliação da expressão miRNA por qRT-PCR com um corante intercalante foram estabelecidas13,14, por exemplo, a síntese cDNA com transcriptase reversa, poli(A) polimerase e primers oligo-dT do RNA total extraído. O novo protocolo tem várias vantagens: simplicidade, economia de tempo e redução de erros técnicos. Pode, assim, ser usado para investigações que requerem identificação precisa e sensível de perfis de miRNA renal e soro. Estudos de muitas condições patológicas também podem utilizar o novo protocolo.
Os perfis de expressão miRNA em camundongos SAMP1, que são um modelo de comprometimento renal dependente da idade, podem ser determinados como mostrado abaixo. Em humanos, o comprometimento renal dependente da idade está associado à progressão da insuficiência renal e é caracterizado tanto pelo aumento da área de fibrose intersticial renal quanto pela progressão da glomerulosclerose15,16. O comprometimento renal dependente da idade também é uma característica importante e frequente da doença renal crônica e da doença renal em estágio terminal15,16.
Os níveis de expressão dos miRNAs alvo foram determinados com sucesso pelo protocolo acima descrito usando qRT-PCR. A avaliação dos miRNAs extraídos é um passo importante na obtenção de dados significativos de qRT-PCR. Para confirmar a qualidade adequada dos miRNAs antes de realizar o qRT-PCR, a espectrofotometria deve ser usada para determinar a razão de absorvância em 260 nm para a de 280 nm. A contaminação do DNA pode ocorrer, e/ou os dimers de primer em cada poço da placa de reação podem estar presentes se o qRT-PCR não fornecer uma única amplificação pcr do comprimento esperado e temperatura de fusão, ou se fornece uma curva de fusão monomodal.
Os níveis de expressão do MiRNA podem ser avaliados por vários métodos que não o qRT-PCR, incluindo manchas do norte, uma microarray e ensaios de proteção à ribonuclease. No entanto, o método qRT-PCR é um procedimento sensível, preciso, simples e reprodutível que requer um volume amostral menor do que os necessários para os ensaios de proteção de manchas do norte e ribonuclease19. Uma vez que as microarrays podem medir a expressão de dezenas de milhares de miRNAs simultaneamente, elas podem ser usadas para identificar marcadores miRNA candidatos. Os dados da microarray também mostram uma alta correlação global com os dados obtidos pelo qRT-PCR20. No entanto, não foi alcançado consenso quanto à metodologia ideal para comparação de dados de microarray obtidos em diferentes estudos21.
A avaliação do soro miRNAs tem as seguintes características. Primeiro, é fácil coletar soro, e como os miRNAs soro são estáveis contra congelamento e descongelamento, temperatura e ácido, os miRNAs podem ser bons biomarcadores. Em segundo lugar, há alta homologia de miRNAs entre as espécies, e os resultados de experimentos em animais são facilmente extrapolados para os seres humanos. Em terceiro lugar, os miRNAs soro têm mostrado potencial de uso como drogas terapêuticas3. Vários estudos também demonstraram que o nível de expressão do miRNA nos órgãos está correlacionado com o miRNA no soro 22,23,24. No presente estudo, o miRNA-223-3p, dos quais os níveis renais não apresentaram diferença significativa entre os camundongos SAMR1 e SAMP1, também não mostrou diferença significativa entre a cepa no soro. Em contraste, miRNA-7218-5p e miRNA-7219-5p, dos quais os níveis renais mostraram uma diferença significativa entre os camundongos SAMR1 e SAMP1, mostraram diferenças consideráveis entre as cepas no soro.
Este protocolo tem as seguintes limitações. Primeiro, sua utilidade não foi verificada em outros órgãos, como fígado e pulmão, e segundo, não foi testada em outros animais de laboratório, como ratos, cães e suínos. Vários grupos de pesquisa utilizaram este protocolo para a purificação e detecção de miRNAs por qRT-PCR e relataram que este protocolo permitiu a purificação de RNA de alta qualidade de tecidos e soro 13,14,22,23,24. Este método demonstrou ter alta precisão e sensibilidade para detectar a expressão de miRNAs 13,14,22,23,24. Os resultados do presente estudo demonstram que este protocolo pode detectar com sucesso a expressão miRNA no soro e rim de camundongos. Portanto, o protocolo pode ser usado para determinar os perfis de expressão de miRNA sérico e renal em camundongos com uma variedade de patologias. Devido à simplicidade do protocolo, um grande número de amostras pode ser processado simultaneamente. Análises da expressão de muitos miRNAs em várias condições patológicas do rim podem, assim, usar o protocolo aqui descrito.
Há certos aspectos do protocolo a ter em mente. Para evitar a degradação dos miRNAs purificados que ocorreriam à temperatura ambiente, as miRNAs devem ser mantidas no gelo. As amostras de rim devem ser homogeneizadas até que estejam completamente dissolvidas no reagente da lise. O rim do rato contém uma quantidade substancial de tecido conjuntivo insolúvel no reagente de lise, e assim é necessário um triturador de coluna para maior homogeneização. Além disso, o miRNA de controle endógeno apropriado (com expressão estável entre as amostras) deve ser validado durante toda a configuração de um experimento qRT-PCR. Isso ocorre porque a interferência de várias substâncias durante o desempenho deste protocolo pode alterar os níveis de expressão de miRNAs de controle endógeno, possivelmente comprometendo os resultados. Em conclusão, este artigo descreve um protocolo qRT-PCR para detecção, purificação e avaliação da expressão miRNA no soro e rim de camundongos com comprometimento renal dependente da idade.
The authors have nothing to disclose.
Nenhum.
1.0 mL spitz with heparin | Greiner-bio-one | 450534 | |
Buffer RPE (wash buffer #2 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:4) | Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 |
Buffer RWT (wash buffer #1 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:2) | Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 |
MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate |
miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00003871 | 5'-CGUGUAUUUGACAAGCUGAGUU G-3' |
miRNA-423-5p primer | Qiagen | MS00012005 | 5'-UGAGGGGCAGAGAGCGAGACU UU-3' |
miRNA-7218-5p primer | Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG -3' |
miRNA-7219-5p primer | Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGA GA-3' |
miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube |
miRNeasy Serum/Plasma kit | Qiagen | 217184 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube |
miScript II RT kit (reverse transcription buffer) | Qiagen | 218161 | Reverse transcriptase kit |
miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Green dye-based PCR kit |
QIA shredder | Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube |
QIAzol Lysis Reagent (phenol/guanidine-based lysis reagent) | Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent |
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument |
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software |
RNase-free water | Qiagen | 129112 | |
RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Not disclosed due to confidentiality |
SAMP1 male mice | Nippon SLC Corporation | Not assigned | |
SAMR1 male mice | Nippon SLC Corporation | Not assigned | |
Takara biomasher standard | Takara Bio | 9790B | Silicon homogenizer |