Presentamos un método para evaluar la expresión de microARN en el riñón y el suero de ratones con insuficiencia renal dependiente de la edad mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa.
Los microARN (miARN) son pequeños ARN no codificantes que constan de 21-25 bases. No se traducen en proteínas, sino que trabajan para impedir el funcionamiento de sus ARN mensajeros objetivo (ARNm) desestabilizándolos e interrumpiendo su traducción. Aunque se han investigado los perfiles de expresión de miARN en varios órganos y tejidos de ratón, no ha habido métodos estándar para purificar y cuantificar miARN de riñón y suero de ratón. Hemos establecido un método eficaz y fiable para extraer y evaluar la expresión de miRNA en suero y riñón de ratones con insuficiencia renal dependiente de la edad.
El método utiliza la reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa con transcripción inversa (qRT-PCR), y el protocolo requiere seis pasos: (1) preparación de ratones con resistencia de ratón acelerada por senescencia 1 (SAMR1) y ratones propensos a ratones con propenso a la senescencia acelerada (SAMP1); (2) extraer muestras de suero de estos ratones; (3) extraer una muestra de riñón de cada ratón; (4) extraer ARN total (incluido miARN) de muestras de riñón y suero de cada ratón; (5) la síntesis de ADN complementario (ADNc) con transcripción inversa del miARN; (6) realizar una qRT-PCR utilizando el ADNc obtenido.
Este protocolo se utilizó para confirmar que, en comparación con los controles, la expresión de miRNA-7218-5p y miRNA-7219-5p cambió significativamente en el riñón y el suero de un modelo de ratón de insuficiencia renal dependiente de la edad. Este protocolo también aclaró la relación entre el riñón y el suero del modelo de ratón de insuficiencia renal dependiente de la edad. Este protocolo se puede utilizar para determinar la expresión de miARN en el riñón y el suero de ratones con insuficiencia renal dependiente de la edad.
Se sabe que la expresión de varios ARNm que desempeñan un papel importante tanto en la fisiología como en la enfermedad (por ejemplo, inflamación, fibrosis, trastornos metabólicos y cáncer) está regulada por miARN, que son ARN cortos y no codificantes que causan la degradación e inhiben la transcripción del ARNm1. Por lo tanto, es posible que ciertos miRNAs puedan servir como nuevos candidatos a biomarcadores y/o dianas terapéuticas para diversas enfermedades 2,3,4,5. Se han realizado investigaciones sobre perfiles de expresión de miARN en una variedad de órganos y tejidos de ratón (incluidos el cerebro6, el corazón7, el pulmón8, el hígado9 y el riñón10). Sin embargo, no existen métodos estándar o establecidos para extraer y evaluar miRNAs en los riñones o suero de ratones con insuficiencia renal dependiente de la edad.
Por lo tanto, establecimos un protocolo que se puede utilizar para purificar y detectar de manera confiable la expresión de miRNA en el suero y el riñón de ratones con insuficiencia renal dependiente de la edad. Hay seis pasos principales en el protocolo: (1) preparación de ratones machos SAMR1 de 50 semanas de edad y ratones machos SAMP1; (2) extracción de muestras de sangre de la vena cava inferior de ambas cepas de ratones, con el uso posterior de un tubo de spitz con heparina, seguido de centrifugación, para obtener una muestra de suero; (3) extracción de muestras de riñón de los ratones: se utiliza un homogeneizador de silicio para homogeneizar la muestra de riñón por separado, y luego la muestra se transfiere a un sistema de trituración de biopolímeros en una columna de centrifugación de microcentrífuga11; (4) extracción de ARN total (que contiene miARN) de las muestras de suero con el uso de una columna de espín12 basada en membrana de sílice y extracción total de ARN que contiene miARN de las muestras renales con el uso de una columna de espín11 basada en membrana de sílice; (5) síntesis de ADN complementario (ADNc) a partir del ARN total utilizando transcriptasa inversa, poli(A) polimerasa y oligo-dT cebador13,14; y (6) finalmente, determinación de la expresión de miRNA mediante qRT-PCR y un colorante intercalante13,14.
Este nuevo protocolo se basó en estudios que lograron extraer y evaluar miRNAs en varios tipos de tejido11,12,13. Se demostró que el sistema de trituración de biopolímeros del protocolo es capaz de purificar ARN total de alta calidad de los tejidos11. Se ha establecido la precisión y sensibilidad de aspectos de este protocolo utilizado para la evaluación de la expresión de miARN por qRT-PCR con un colorante intercalante13,14, por ejemplo, la síntesis de ADNc con transcriptasa inversa, poli(A) polimerasa y cebadores oligo-dT a partir del ARN total extraído. El nuevo protocolo tiene varias ventajas: simplicidad, ahorro de tiempo y reducción de errores técnicos. Por lo tanto, se puede utilizar para investigaciones que requieren una identificación precisa y sensible de los perfiles de miARN renal y sérico. Los estudios de muchas condiciones patológicas también pueden utilizar el nuevo protocolo.
Los perfiles de expresión de miARN en ratones SAMP1, que son un modelo de insuficiencia renal dependiente de la edad, se pueden determinar como se muestra a continuación. En humanos, la insuficiencia renal dependiente de la edad se asocia con la progresión de la insuficiencia renal y se caracteriza tanto por un aumento en el área de fibrosis intersticial renal como por la progresión de la glomeruloesclerosis15,16. La insuficiencia renal dependiente de la edad también es una característica importante y frecuente de la enfermedad renal crónica y de la enfermedad renal terminal15,16.
Los niveles de expresión de los miRNAs diana se determinaron con éxito mediante el protocolo descrito anteriormente utilizando qRT-PCR. La evaluación de los miRNAs extraídos es un paso importante para obtener datos significativos de qRT-PCR. Para confirmar la calidad adecuada de los miRNAs antes de realizar la qRT-PCR, se debe utilizar espectrofotometría para determinar la relación de absorbancia a 260 nm a 280 nm. Puede producirse contaminación por ADN y/o dímeros de cebador en cada pocillo de la placa de reacción si la qRT-PCR no proporciona una sola amplificación por PCR de la longitud esperada y la temperatura de fusión, o si proporciona una curva de fusión monomodal.
Los niveles de expresión de MiRNA se pueden evaluar mediante varios métodos distintos de qRT-PCR, incluyendo northern blotting, un microarray y ensayos de protección de ribonucleasa. Sin embargo, el método qRT-PCR es un procedimiento sensible, preciso, simple y reproducible que requiere un volumen de muestra menor que los requeridos para los ensayos de Northern Blot y protección contra ribonucleasa19. Dado que los microarrays pueden medir la expresión de decenas de miles de miRNAs simultáneamente, pueden usarse para identificar marcadores de miRNA candidatos. Los datos de microarrays también muestran una alta correlación general con los datos obtenidos por qRT-PCR20. Sin embargo, no se ha llegado a un consenso sobre la metodología óptima para comparar los datos de microarrays obtenidos en diferentes estudios21.
La evaluación de los miRNAs séricos tiene las siguientes características. En primer lugar, es fácil recolectar suero, y como los miARN séricos son estables contra la congelación y descongelación, la temperatura y el ácido, los miARN pueden ser buenos biomarcadores. En segundo lugar, existe una alta homología de miARN entre especies, y los resultados de los experimentos con animales se extrapolan fácilmente a los humanos. En tercer lugar, los miRNAs séricos han mostrado potencial para su uso como fármacos terapéuticos3. Varios estudios también han demostrado que el nivel de expresión de miRNA en órganos se correlaciona con miRNA en suero22,23,24. En el presente estudio, miRNA-223-3p, cuyos niveles renales no mostraron una diferencia significativa entre los ratones SAMR1 y SAMP1, tampoco mostraron diferencias significativas entre cepas en el suero. En contraste, miRNA-7218-5p y miRNA-7219-5p, cuyos niveles renales mostraron una diferencia significativa entre los ratones SAMR1 y SAMP1, mostraron diferencias considerables entre cepas en el suero.
Este protocolo tiene las siguientes limitaciones. En primer lugar, su utilidad no se ha verificado en otros órganos como el hígado y el pulmón, y en segundo lugar, no se ha probado en otros animales de laboratorio como ratas, perros y cerdos. Varios grupos de investigación han utilizado este protocolo para la purificación y detección de miRNAs mediante qRT-PCR y han informado de que este protocolo permitió la purificación de ARN de alta calidad a partir de tejidos y suero 13,14,22,23,24. Se ha demostrado que este método tiene una alta precisión y sensibilidad para detectar la expresión de miRNAs 13,14,22,23,24. Los resultados del presente estudio demuestran que este protocolo puede detectar con éxito la expresión de miARN en el suero y el riñón de ratones. Por lo tanto, el protocolo se puede utilizar para determinar los perfiles de expresión de miARN sérico y renal en ratones con una variedad de patologías. Debido a la simplicidad del protocolo, se puede procesar simultáneamente un gran número de muestras. Los análisis de la expresión de muchos miRNAs en diversas condiciones patológicas del riñón pueden, por lo tanto, utilizar el protocolo descrito en este documento.
Hay ciertos aspectos del protocolo a tener en cuenta. Para evitar la degradación de los miARN purificados que ocurriría a temperatura ambiente, los miARN deben mantenerse en hielo. Las muestras de riñón deben homogeneizarse hasta que se disuelvan completamente en el reactivo de lisis. El riñón de ratón contiene una cantidad sustancial de tejido conectivo que es insoluble en el reactivo de lisis y, por lo tanto, se requiere una trituradora de columna para una mayor homogeneización. Además, el miARN de control endógeno apropiado (con expresión estable entre las muestras) debe validarse a lo largo de la configuración de un experimento qRT-PCR. Esto se debe a que la interferencia de diversas sustancias durante la realización de este protocolo puede alterar los niveles de expresión de los miRNAs de control endógenos, posiblemente comprometiendo los resultados. En conclusión, este artículo describe un protocolo qRT-PCR para la detección, purificación y evaluación de la expresión de miRNA en suero y riñón de ratones con insuficiencia renal dependiente de la edad.
The authors have nothing to disclose.
Ninguno.
1.0 mL spitz with heparin | Greiner-bio-one | 450534 | |
Buffer RPE (wash buffer #2 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:4) | Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 |
Buffer RWT (wash buffer #1 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:2) | Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 |
MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate |
miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00003871 | 5'-CGUGUAUUUGACAAGCUGAGUU G-3' |
miRNA-423-5p primer | Qiagen | MS00012005 | 5'-UGAGGGGCAGAGAGCGAGACU UU-3' |
miRNA-7218-5p primer | Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG -3' |
miRNA-7219-5p primer | Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGA GA-3' |
miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube |
miRNeasy Serum/Plasma kit | Qiagen | 217184 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube |
miScript II RT kit (reverse transcription buffer) | Qiagen | 218161 | Reverse transcriptase kit |
miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Green dye-based PCR kit |
QIA shredder | Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube |
QIAzol Lysis Reagent (phenol/guanidine-based lysis reagent) | Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent |
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument |
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software |
RNase-free water | Qiagen | 129112 | |
RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Not disclosed due to confidentiality |
SAMP1 male mice | Nippon SLC Corporation | Not assigned | |
SAMR1 male mice | Nippon SLC Corporation | Not assigned | |
Takara biomasher standard | Takara Bio | 9790B | Silicon homogenizer |