Zuivering van endogene Drosophila Transient Receptor Potential Channels
Summary
Op basis van het assemblagemechanisme van het INAD-eiwitcomplex werd in dit protocol een aangepaste affiniteitszuivering plus concurrentiestrategie ontwikkeld om het endogene Drosophila TRP-kanaal te zuiveren.
Abstract
Drosophila fototransductie is een van de snelst bekende G-eiwit-gekoppelde signaalroutes. Om de specificiteit en efficiëntie van deze cascade te garanderen, bindt het calcium (Ca2+)-permeabele kationkanaal, transient receptor potential (TRP), zich stevig aan het steigereiwit, inactivatie-no-after-potential D (INAD), en vormt een groot signaleringseiwitcomplex met oogspecifiek eiwitkinase C (ePKC) en fosfolipase Cβ/No-receptorpotentiaal A (PLCβ/NORPA). De biochemische eigenschappen van het Drosophila TRP-kanaal blijven echter onduidelijk. Op basis van het assemblagemechanisme van het INAD-eiwitcomplex werd een aangepaste affiniteitszuivering plus concurrentiestrategie ontwikkeld om het endogene TRP-kanaal te zuiveren. Ten eerste werd het gezuiverde histidine (His)-gelabelde NORPA 863-1095-fragment gebonden aan Ni-kralen en gebruikt als lokaas om het endogene INAD-eiwitcomplex uit Drosophila-hoofdhomogenaten naar beneden te halen. Vervolgens werd overmatig gezuiverd glutathion S-transferase (GST)-gelabeld TRP 1261-1275-fragment toegevoegd aan de Ni-kralen om te concurreren met het TRP-kanaal. Ten slotte werd het TRP-kanaal in het supernatant gescheiden van het overmatige TRP 1261-1275-peptide door grootte-uitsluitingschromatografie. Deze methode maakt het mogelijk om het gatingmechanisme van het Drosophila TRP-kanaal te bestuderen vanuit zowel biochemische als structurele hoeken. De elektrofysiologische eigenschappen van gezuiverde Drosophila TRP-kanalen kunnen ook in de toekomst worden gemeten.
Introduction
Fototransductie is een proces waarbij geabsorbeerde fotonen worden omgezet in elektrische codes van neuronen. Het geeft uitsluitend opsinen en de volgende G-eiwit-gekoppelde signaleringscascade door bij zowel gewervelde als ongewervelde dieren. In Drosophila organiseert scaffold protein inactivation-no-after-potential D (INAD) met behulp van zijn vijf PDZ-domeinen een supramoleculair signaleringscomplex, dat bestaat uit een transient receptor potential (TRP) kanaal, fosfolipase Cβ/No receptor potential A (PLCβ/NORPA) en oogspecifiek eiwitkinase C (ePKC)1. De vorming van dit supramoleculaire signaleringscomplex garandeert de juiste subcellulaire lokalisatie, hoge efficiëntie en specificiteit van Drosophila-fototransductiemachines. In deze complexe, lichtgevoelige TRP fungeren kanalen als downstream effectoren van NORPA en bemiddelen calciuminstroom en de depolarisatie van fotoreceptoren. Eerdere studies toonden aan dat de opening van het Drosophila TRP-kanaal wordt gemedieerd door protonen, verstoring van de lokale lipidenomgeving of mechanische kracht 2,3,4. Het Drosophila TRP-kanaal interageert ook met calmodulin5 en wordt gemoduleerd door calcium door zowel positieve als negatieve feedback 6,7,8.
Tot nu toe waren elektrofysiologische studies over het gatingmechanisme van Drosophila TRP- en TRP-achtige (TRPL) kanalen gebaseerd op weggesneden membraanpleisters, hele-cel opnames van gedissocieerde wild-type Drosophila-fotoreceptoren en hetero-uitgedrukte kanalen in S2-, SF9- of HEK-cellen 2,9,10,11,12,13, maar niet op gezuiverde kanalen. De structurele informatie van het drosophila TRP-kanaal over de volledige lengte blijft ook onduidelijk. Om de elektrofysiologische eigenschappen van gezuiverd eiwit in een gereconstitueerde membraanomgeving te bestuderen en structurele informatie te verkrijgen over het Drosophila TRP-kanaal over de volledige lengte, is het verkrijgen van gezuiverde TRP-kanalen over de volledige lengte de noodzakelijke eerste stap, vergelijkbaar met de methodologieën die worden gebruikt in TRP-kanaalstudies van zoogdieren 14,15,16,17.
Onlangs werd op basis van het assemblagemechanisme van INAD-eiwitcomplex 18,19,20 voor het eerst een affiniteitszuiverings- plus concurrentiestrategie ontwikkeld om het TRP-kanaal te zuiveren van Drosophila-hoofdhomogenaten door streptavidin-kralen 5. Gezien de lage capaciteit en de dure kosten van streptavidin-kralen, wordt hier een verbeterd zuiveringsprotocol geïntroduceerd dat his-tagged aaseiwit en bijbehorende goedkope Ni-kralen met een veel hogere capaciteit gebruikt. De voorgestelde methode zal helpen om het gatingmechanisme van het TRP-kanaal vanuit structurele hoeken te bestuderen en de elektrofysiologische eigenschappen van het TRP-kanaal te meten met gezuiverde eiwitten.
Protocol
Representative Results
Discussion
INAD, dat vijf PDZ-domeinen bevat, is de kernorganisator van Drosophila-fototransductiemachines. Eerdere studies toonden aan dat INAD PDZ3 bindt aan de TRP-kanaal C-terminale staart met een voortreffelijke specificiteit (KD = 0,3 μM)18. INAD PDZ45 tandem interageert met NORPA 863-1095 fragment met een extreem hoge binding affiniteit (KD = 30 nM). Deze bevindingen bieden een solide biochemische basis voor het ontwerpen van de affiniteitszuivering plus concurrentiestr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 31870746), Shenzhen Basic Research Grants (JCYJ20200109140414636) en natural science foundation van de provincie Guangdong, China (nr. 2021A1515010796) aan W. L. Wij danken LetPub (www.letpub.com) voor haar taalkundige hulp bij de voorbereiding van dit manuscript.
Materials
| Bacterial strains | |||
| BL21(DE3) Competent Cells | Novagen | 69450 | Protein overexpression |
| Experiment models | |||
| D.melanogaster: W1118 strain | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC:3605 | Drosophila head preparation |
| Material | |||
| 20/30/40 mesh stainless steel sieves | Jiufeng metal mesh company | GB/T6003.1 | Drosophila head preparation |
| 30% Acrylamide-N,N′-Methylenebisacrylamide(29:1) | Lablead | A3291 | SDS-PAGE gel preparation |
| Ammonium Persulfate | Invitrogen | HC2005 | SDS-PAGE gel preparation |
| Cocktail protease inhibitor | Roche | 05892953001 | Protease inhibitor |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech | A100472-0025 | SDS-PAGE gel staining |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sangon Biotech | A620058-0100 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) | Sangon Biotech | A500838-0500 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Glycine | Sangon Biotech | A610235-0005 | SDS-PAGE buffer preparation |
| Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads | Cytiva | 17513202 | Affinity chromatography |
| Imidazole | Sangon Biotech | A500529-0001 | Elution buffer preparation for Ni-column |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sangon Biotech | A600168-0025 | Induction of protein overexpression |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002-0250 | E.coli. cell culture |
| L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma-aldrich | G4251-100G | Elution buffer preparation for Glutathione beads |
| Ni-Sepharose excel beads | Cytiva | 17371202 | Affinity chromatography |
| N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM) | Sangon Biotech | A610424-001 | Detergent for protein purification |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-aldrich | T9281-100ML | SDS-PAGE gel preparation |
| PBS | Sangon Biotech | E607008-0500 | Homogenization buffer for E.coli. cell |
| PMSF | Lablead | P0754-25G | Protease inhibitor |
| Prestained protein marker | Thermo Scientific | 26619/26616 | Prestained protein ladder |
| Size exclusion column (preparation grade) | Cytiva | 28989336 | HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column |
| Size exclusion column (analytical grade) | Cytiva | 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL column |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218-0001 | Protein purification buffer preparation |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sangon Biotech | A500228-0001 | SDS-PAGE gel/buffer preparation |
| Tris base | Sigma-aldrich | T1503-10KG | Protein purification buffer preparation |
| Ultrafiltration spin column | Millipore | UFC901096/801096 | Protein concentration |
| Equipment | |||
| Analytical Balance | DENVER | APX-60 | Metage of Drosophila head |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes | Eppendorf | 5810R | Protein concentration |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes | Eppendorf | 5417R | Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm) | Bio-Rad | 738-0015 | TRP protein purification |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm) | Bio-Rad | 738-0017 | Bait and competitor protein purification from E.coli. |
| Gel Documentation System | Bio-Rad | Universal Hood II Gel Doc XR System | SDS-PAGE imaging |
| High-speed refrigerated centrifuge | Beckman coulter | Avanti J-26 XP | Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate |
| High pressure homogenizer | UNION-BIOTECH | UH-05 | Homogenization of E.coli. cells |
| Liquid nitrogen tank | Taylor-Wharton | CX-100 | Drosophila head preparation |
| Protein purification system | Cytiva | AKTA purifier | Protein purification |
| Refrigerator (-80°C) | Thermo | 900GP | Drosophila head preparation |
| Spectrophotometer | MAPADA | UV-1200 | OD600 measurement of E.coli. cells |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000c | Determination of protein concentration |
| Ultracentrifuge | Beckman coulter | Optima XPN-100 Ultracentrifuge | Ultracentrifugation |
References
- Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
- Huang, J., et al. Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors. Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).
- Chyb, S., Raghu, P., Hardie, R. C. Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL. Nature. 397 (6716), 255-259 (1999).
- Hardie, R. C., Franze, K. Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors. Science. 338 (6104), 260-263 (2012).
- Chen, W., et al. Calmodulin binds to Drosophila TRP with an unexpected mode. Structure. 29 (4), 330-344 (2021).
- Hardie, R. C. Effects of intracellular Ca2+ chelation on the light response in Drosophila photoreceptors. Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 177 (6), 707-721 (1995).
- Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo. Cell. 91 (3), 375-383 (1997).
- Hardie, R. C., Minke, B. Phosphoinositide-mediated phototransduction in Drosophila photoreceptors: the role of Ca2+ and trp. Cell Calcium. 18 (4), 256-274 (1995).
- Delgado, R., et al. Light-induced opening of the TRP channel in isolated membrane patches excised from photosensitive microvilli from Drosophila photoreceptors. Neuroscience. 396, 66-72 (2019).
- Lev, S., Katz, B., Minke, B. The activity of the TRP-like channel depends on its expression system. Channels (Austin). 6 (2), 86-93 (2012).
- Hardie, R. C., Raghu, P. Activation of heterologously expressed Drosophila TRPL channels: Ca2+ is not required and InsP3 is not sufficient. Cell Calcium. 24 (3), 153-163 (1998).
- Gutorov, R., et al. Modulation of transient receptor potential C channel activity by cholesterol. Frontiers in Pharmacology. 10, 1487 (2019).
- Yagodin, S., et al. Thapsigargin and receptor-mediated activation of Drosophila TRPL channels stably expressed in a Drosophila S2 cell line. Cell Calcium. 23 (4), 219-228 (1998).
- Guo, W., Chen, L. Recent progress in structural studies on canonical TRP ion channels. Cell Calcium. 83, 102075 (2019).
- Li, X., Fine, M. TRP channel: The structural era. Cell Calcium. 87, 102191 (2020).
- Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
- Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504 (7478), 113-118 (2013).
- Liu, W., et al. The INAD scaffold is a dynamic, redox-regulated modulator of signaling in the Drosophila eye. Cell. 145 (7), 1088-1101 (2011).
- Ye, F., Liu, W., Shang, Y., Zhang, M. An exquisitely specific PDZ/target recognition revealed by the structure of INAD PDZ3 in complex with TRP channel. Structure. 24 (3), 383-391 (2016).
- Ye, F., et al. An unexpected INAD PDZ tandem-mediated plcβ binding in Drosophila photo receptors. eLife. 7, (2018).
- Rahimzadeh, M., Sadeghizadeh, M., Najafi, F., Arab, S., Mobasheri, H. Impact of heat shock step on bacterial transformation efficiency. Molecular Biology Research Communications. 5 (4), 257-261 (2016).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, S. . Drosophila: A laboratory handbook. Second Edition. 80 (2), (2005).
- Nicolas, G., Sillans, D. Immediate and latent effects of carbon dioxide on insects. Annual Review of Entomology. 34 (1), 97-116 (1989).
- Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
- Hellmich, U. A., Gaudet, R. Structural biology of TRP channels. Handbook of Experimental Pharmacology. 223, 963-990 (2014).
