Summary
INAD 단백질 복합체의 조립 메카니즘에 기초하여, 이 프로토콜에서, 내인성 초파리 TRP 채널을 정제하기 위해 변형된 친화성 정제 플러스 경쟁 전략이 개발되었다.
Abstract
초파리 광형질도입은 가장 빠르게 알려진 G 단백질 결합 신호전달 경로 중 하나이다. 이 캐스케이드의 특이성과 효율을 보장하기 위해, 칼슘 (Ca2+)-투과성 양이온 채널, 일시적 수용체 전위 (TRP)는 스캐폴드 단백질에 긴밀하게 결합하고, 불활성화-불활성화-무-전위 D(INAD), 그리고 눈 특이적 단백질 키나아제 C(ePKC) 및 포스포리파제 Cβ/No 수용체 전위 A(PLCβ/NORPA)와 함께 큰 신호전달 단백질 복합체를 형성한다. 그러나 초파리 TRP 채널의 생화학 적 특성은 불분명하다. INAD 단백질 복합체의 조립 메카니즘에 기초하여, 내인성 TRP 채널을 정제하기 위해 변형된 친화성 정제 플러스 경쟁 전략이 개발되었다. 먼저, 정제된 히스티딘 (His)-태깅된 NORPA 863-1095 단편을 Ni-비드에 결합시키고, 초파리 머리 균질물로부터 내인성 INAD 단백질 복합체를 끌어내리기 위한 미끼로 사용하였다. 이어서, 과량의 정제된 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST)-태깅된 TRP 1261-1275 단편을 TRP 채널과 경쟁하기 위해 Ni-비드에 첨가하였다. 마지막으로, 상청액 내의 TRP 채널을 크기 배제 크로마토그래피에 의해 과도한 TRP 1261-1275 펩티드로부터 분리하였다. 이 방법은 생화학 적 및 구조적 각도 모두에서 초파리 TRP 채널의 게이팅 메커니즘을 연구 할 수있게합니다. 정제된 초파리 TRP 채널의 전기생리학적 특성은 또한 미래에 측정될 수 있다.
Introduction
광전달은 흡수된 광자가 뉴런의 전기 코드로 변환되는 과정입니다. 그것은 독점적으로 척추 동물과 무척추 동물 모두에서 옵신과 다음 G 단백질 결합 신호 전달 캐스케이드를 전달합니다. 초파리에서, 그의 다섯 PDZ 도메인을 사용하여, 스캐폴드 단백질 불활성화-없음-사후 전위 D(INAD)는 일시적인 수용체 전위(TRP) 채널, 포스포리파제 Cβ/No 수용체 전위 A(PLCβ/NORPA) 및 눈 특이적 단백질 키나아제 C(ePKC)1로 구성된 초분자 신호전달 복합체를 조직한다. 이 초분자 신호 복합체의 형성은 Drosophila 광전달 기계의 정확한 세포 내 국소화, 고효율 및 특이성을 보장합니다. 이 복합체에서 빛에 민감한 TRP 채널은 NORPA의 하류 이펙터 역할을하며 칼슘 유입과 광수용체의 탈분극을 매개합니다. 이전의 연구는 초파리 TRP 채널의 개방이 양성자, 국소 지질 환경의 파괴 또는 기계적 힘 2,3,4에 의해 매개된다는 것을 보여주었습니다. 초파리 TRP 채널은 또한 calmodulin 5와 상호 작용하며 긍정적 인 피드백과 부정적인 피드백 6,7,8 모두에 의해 칼슘에 의해 변조됩니다.
지금까지 초파리 TRP 및 TRP 유사 (TRPL) 채널의 게이팅 메커니즘에 대한 전기 생리학 연구는 절제된 막 패치, 해리 된 야생형 초파리 광수용체로부터의 전체 세포 기록 및 S2, SF9 또는 HEK 세포 2,9,10,11,12,13의 헤테로 발현 채널을 기반으로했지만 정제 된 채널에서는 그렇지 않았습니다. 전장 초파리 TRP 채널의 구조 정보도 불분명하다. 재구성된 막 환경에서 정제된 단백질의 전기생리학적 특성을 연구하고 전장 초파리 TRP 채널의 구조적 정보를 얻기 위해, 정제된 전장 TRP 채널을 얻는 것은 포유동물 TRP 채널 연구14,15,16,17에서 사용된 방법론과 유사한 첫 번째 단계이다.
최근에, INAD 단백질 복합체18,19,20의 조립 메카니즘에 기초하여, 스트렙타비딘 비드5에 의해 초파리 머리 균질물로부터 TRP 채널을 정제하기 위해 친화성 정제 플러스 경쟁 전략이 처음 개발되었다. 스트렙타비딘 비드의 낮은 용량과 비싼 비용을 고려하여, His-태깅된 미끼 단백질과 훨씬 더 높은 용량의 상응하는 저가의 Ni-비드를 사용하는 개선된 정제 프로토콜이 여기에 도입된다. 제안된 방법은 구조적 각도에서 TRP 채널의 게이팅 메카니즘을 연구하고 정제된 단백질로 TRP 채널의 전기생리학적 특성을 측정하는 데 도움이 될 것이다.
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Protocol
1. GST 태깅된 TRP 및 그의 태그된 NORPA 단편의 정제
- GST 태그 TRP 1261-1275 단편 정화
- pGEX 4T-1 TRP 1261-1275 플라스미드10을 CaCl2 열충격형질전환 방법 21을 이용하여 대장균(E. coli) BL21(DE3) 세포로 형질전환시킨다. 단일 콜로니를 10 mL의 루리아 베르타니(LB) 배지에 접종하고 37°C에서 밤새 성장시킨다. 이어서, 시딩 배양액 10 mL를 37°C에서 LB 배지 1 L로 증폭시킨다.
- 세포의 광학 밀도 (OD600)가 0.5에 도달한 후, 세포를 16°C로 냉각시키고 0.1 mM 이소프로필β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG; 최종 농도)를 첨가하여 표적 단백질의 과발현을 유도하고16°C에서 18시간 동안 배양하였다.
- 과발현 후, 3,993 × g에서 20 분 동안 원심분리하여 배양된 세포 펠릿 1 L를 40 mL의 포스페이트 완충 식염수(PBS) 완충액에 재현탁시켰다.
- 재현탁된 세포를 4°C에서 예비냉각된 고압 호모게나이저에 로딩한다. 천천히 호모게나이저 압력을 800 bar로 증가시킨다. 입구 탭을 열고 재현탁 된 세포가 매우 좁은 슬릿이있는 밸브를 원형으로 통과하게하십시오.
참고: 세포는 큰 압력 강하 및 캐비테이션으로 인한 높은 전단력에 의해 균질화됩니다. - 5 mL의 글루타티온 비드를 중력 유동 컬럼에 로딩하고, 비드를 총 3회 동안 PBS 버퍼 50 mL로 세척한다.
- 세포 용해물을 고압 호모게나이저로부터 48,384 x g로 원심분리한다. 원심분리된 세포 용해물(40 mL)의 상층액을 중력 유동 컬럼의 평형화된 글루타티온 비드에 첨가하고, 4°C에서 30분 동안 인큐베이션한다. 글루타티온 비드를 10분마다 재현탁합니다.
- 30분 인큐베이션 후, 컬럼 출구 탭을 열어 비드와 유동 관통 분획을 분리하였다. 흐름 통과 분수를 버립니다. 나머지 글루타티온 비드를 PBS 버퍼 50 mL로 두 번 헹구십시오.
- 15 mL의 용출 완충액을 글루타티온 비드에 첨가하고 30분 동안 인큐베이션한다. 10 분마다 구슬을 재현탁하십시오.
- 30분 인큐베이션 후, 50 mL 원뿔형 튜브에서 GST-태깅된 TRP 1261-1275 단편을 용출시키고, 크기-배제 컬럼(준비 등급)에 로딩하고, 이는 50 mM 트리스(pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) 완충액을 사용하여 평형화된다.
- 크기 배제 컬럼의 용출 유속을 3 mL/min으로 유지하십시오. 용출 된 단백질을 5 mL / 튜브의 속도로 수집하십시오.
- 280 nm에서 UV 흡수 신호를 분석하여 크기 배제 컬럼에서 표적 단백질의 피크를 확인하고 SDS-PAGE 겔 분석으로 검증한다 (전기영동 파라미터: 스태킹 겔의 경우 150 V, 분해 겔의 경우 200 V). Coomassie blue R250으로 젤을 얼룩지게하십시오.
- 크기 배제 컬럼으로부터 정제된 GST-태깅된 TRP 1261-1275 단편을 1 mL로 농축하고, 15 mL 한외여과 스핀 컬럼을 사용하여 4°C에서 3,000 x g 에서 원심분리하여 데스크탑 냉장 원심분리기에서 농축하였다.
- Beer-Lambert Law를 사용하여 농축 단백질의 농도를 결정하십시오. 분광광도계를 사용하여 280 nm에서 GST 태깅된 TRP 1261-1275 단편의 UV 흡수를 측정하였다.
- 단백질 서열을 Protparam 프로그램 (https://web.expasy.org/protparam/)으로 임포트하여 280 nm에서 흡광 계수를 구하십시오. 전형적으로, GST 태깅된 TRP 1261-1275의 1 L 배양물은 1 mL의 600 μM 단백질(6 x 10-7 mol)을 산출한다. 필요한 재료 에 대해서는 표 1을 참조하십시오.
- 그의 태그가 붙은 NORPA 863-1095 단편의 정제
- pETM.3C NORPA 863-1095 플라스미드 20을 CaCl2 열충격 형질전환 방법21을 이용하여 대장균 BL21(DE3) 세포로 형질전환시킨다. 단일 콜로니를 LB 배지 10 mL에 접종하고 37°C에서 밤새 성장시킨다. 이어서, 시딩 배양액 10 mL를 LB 배지 1 L에서 37°C에서 증폭시킨다.
- 세포의 OD600이 0.5에 도달한 후, 세포를 16°C로 냉각시키고 0.1 mM IPTG (최종 농도)를 첨가하여 표적 단백질의 과발현을 유도하고16 °C에서 18시간 동안 배양한다.
- 과발현 후, 펠릿 1 L를 3,993 x g에서 20분 동안 원심분리하여 배양된 세포를 40 mL의 결합 완충액에 재현탁시켰다. 다음에, 재현탁된 세포를 단계 1.1.4에 기재된 바와 같이 4°C의 고압 호모게나이저에서 용해시킨다.
- 5 mL의 Ni-비드를 중력 유동 컬럼에 로딩하고 50 mL의 결합 완충액으로 세 번 세척한다.
- 세포 용해물을 고압 호모게나이저로부터 48,384 x g로 원심분리한다. 원심분리된 세포 용해물의 상층액을 중력 유동 컬럼의 평형화된 Ni-비드에 첨가하고, 4°C에서 30분 동안 인큐베이션한다. Ni 비드를 10분마다 재현탁합니다.
- 30분 인큐베이션 후, 컬럼 출구 탭을 열어 비드와 유동 관통 분획을 분리하였다. 유동 스루 분획을 버리고 나머지 Ni-비드를 50 mL의 세척 완충액으로 두 번 세척한다.
- 용출 완충액 15 mL를 Ni-비드에 첨가하고 30분 동안 인큐베이션한다. Ni 비드를 10분마다 재현탁합니다.
- 30분 인큐베이션 후, 용출된 His-태그된 NORPA 863-1095 단편을 50 mL 원뿔형 튜브에 수집하고, 50 mM 트리스(pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT)를 사용하여 평형화되는 크기 배제 컬럼(준비 등급)에 로딩한다.
- 크기 배제 컬럼의 용출 유속을 3 mL/min으로 유지하십시오. 용출 된 단백질을 5 mL / 튜브의 속도로 수집하십시오.
- 280 nm에서 UV 흡수 신호를 분석하여 크기 배제 컬럼에서 표적 단백질의 피크를 확인하고 SDS-PAGE 겔 분석으로 검증한다 (전기영동 파라미터: 스태킹 겔의 경우 150 V, 분해 겔의 경우 200 V). 쿠마시 블루 R250을 사용하여 젤을 얼룩지게하십시오.
- 크기 배제 컬럼으로부터 정제된 His-태깅된 NORPA 863-1095 단편을 1 mL로 농축하고, 15 mL 한외여과 스핀 컬럼을 사용하여 4°C에서 3,000 x g 에서 원심분리하여 데스크탑 냉장 원심분리기에서 농축하였다.
- Beer-Lambert Law를 사용하여 농축 단백질의 농도를 결정하십시오. 분광광도계를 사용하여 280 nm에서 His-태깅된 NORPA 863-1095 단편의 UV 흡수를 측정하였다.
- 단백질 서열을 Protparam 프로그램 (https://web.expasy.org/protparam/)으로 임포트하여 280 nm에서 흡광 계수를 구하십시오. 전형적으로, His-태깅된 NORPA 863-1095 단편의 1 L 배양물은 1 mL의 600 μM 단백질 (6 x 10-7 mol)을 산출한다. 필요한 재료 에 대해서는 표 2를 참조하십시오.
2. 초파리 머리의 준비
- CO2 마취 방법을 사용하여 50 mL 원뿔형 원심분리 튜브에서 성인 파리를 수집22,23; 즉시 액체 질소에서 10 분 동안 동결하고 -80 ° C 냉동고에 보관하십시오.
- 충분한 수의 파리를 수집 한 후 얼어 붙은 50mL 원뿔형 튜브를 손으로 힘차게 흔들어 파리의 다리, 머리, 날개 및 몸을 분리하십시오. 혼합물을 순차적으로 적층된 3개의 미리 냉각된 스테인리스 스틸 체(각각 20/30/40 메쉬 크기)로 옮기고 체를 흔들어 준다.
- 다음으로, 헤드가 40 메쉬 체를 통과 할 수 없으므로 브러시를 사용하여 플라이 헤드를 40 메쉬 체에서 쓸어 내고 50 mL 원뿔형 튜브로 옮긴 다음 -80 ° C에 보관하십시오.
- 파리와 그들의 머리를 지속적으로 수집하여 실험에 필요한 양 (0.5 g)에 도달 할 때까지 -80 °C 냉동고에 보관하십시오. 일반적으로 0.5g의 머리를 수집하려면 50mL 원뿔형 튜브에 35mL의 파리가 필요합니다. 필요한 재료 에 대해서는 표 3을 참조하십시오.
3. 초파리 TRP 채널 정제
- 총 0.5g의 헤드를 계량하고 사전 냉각 된 모르타르 페슬을 사용하여 액체 질소에서 완전히 균질화하십시오. 균질화된 헤드를 10x v/w 용해 완충액(5 mL)에 용해시키고, 4°C의 진탕기에서 20분 동안 인큐베이션한 다음, 4°C에서 20분 동안 20,817 x g 에서 원심분리한다.
- 스핀다운 상청액("20817 g S", 도 4)을 수집하고, 이를 4°C에서 60분 동안 100,000 x g 에서 추가로 원심분리한다. 다음의 풀다운 분석을 위해 스핀 다운 상청액 ("100,000 g S", 도 4)을 사용한다.
- 1 mL의 Ni 비드를 중력 유동 컬럼에 첨가하고, 비드를 10 mL의 이중 증류 H2O (ddH2O)로 4°C에서 총 3회 동안 세척하였다. 비드를 4°C에서 세 번 10 컬럼 부피의 용해 완충액으로 평형화시킨다.
- 500 μL의 600 μM 정제된 His-태깅된 NORPA 863-1095 단백질 (3 x 10-7 mol)을 Ni 컬럼에 첨가하고, 4°C에서 30분 동안 인큐베이션한다. 10 분마다 구슬을 재현탁하십시오.
- 컬럼 출구 탭을 열어 비드와 유동 스루 분획을 분리한다. SDS-PAGE 분석을 위해 플로우 스루 분획을 취한다(NORPA F, 도 4). 이 섹션에서는 미끼 단백질이 Ni 비드에 고정화됩니다.
- Ni 비드를 4°C에서 10 컬럼 부피의 용해 완충액(10 mL)으로 세척하고, SDS-PAGE 분석을 위해 세척 분획을 유지한다(세척 1, 도 4A). 상기 단계를 반복하고 SDS-PAGE 분석을 위해 샘플을 보관한다(세척 2, 도 4A). 이 섹션에서는 Ni 비드의 과도한 미끼 단백질이 제거됩니다.
- 초파리 헤드 균질액의 상층액을 100,000 x g 원심분리 후 4°C에서 Ni 컬럼에 넣고, 여기서 His-태그된 NORPA 863-1095 단편이 고정화되었다.
- 상청액을 Ni 비드와 함께 4°C에서 30분 동안 인큐베이션한다. 10 분마다 구슬을 재현탁하십시오. 이어서, 컬럼 출구 탭을 열어 비드와 유동-관통 분획을 분리한다.
- SDS-PAGE 분석을 위해 상청액을 수집한다(Dro head lysis F, 도 4A). 이 섹션에서, 헤드 균질물 내의 INAD 단백질 복합체 (INAD/TRP/ePKC)는 Ni-비드 상에 고정화된 NORPA 863-1095 단편에 의해 포획된다.
- Ni 비드를 4°C에서 10 컬럼 부피의 용해 완충액(10 mL)으로 세척하고, SDS-PAGE 분석을 위해 중력 침전으로부터 상청액을 유지한다(세척 3, 도 4A). 상기 단계를 반복하고 SDS-PAGE 분석을 위해 상청액을 수집한다(세척 4, 도 4A). 이 섹션에서는 Ni 비드 상의 결합되지 않은 단백질이 제거됩니다.
- 500 μL의 600 μM의 GST-태깅된 TRP 1261-1275 단백질 (3 x 10-7 mol)을 Ni- 비드에 첨가하고, 4°C에서 20분 동안 인큐베이션한다. 10 분마다 구슬을 재현탁하십시오.
- 내인성 초파리 TRP 채널을 포함하는 중력 컬럼 (TRP E1, 도 4B)으로부터 용출된 분획을 수집한다. 상기 단계를 반복하고 용출 분획을 수집한다(TRP E2, 도 4B). 이 단계에서, GST 태깅된 TRP 1261-1275 단편을 경쟁자로서 사용함으로써, TRP 채널은 Ni-비드 상의 포획된 INAD 단백질 복합체(INAD/TRP/ePKC)로부터 용출된다.
- Ni-비드를 10 컬럼 부피의 결합 완충액 (10 mL; 표 1) 4°C에서 SDS-PAGE 분석을 위해 세척 분획을 수집하였다(세척 5, 도 4B).
- 500 μL의 용출 완충액(표 1)을 Ni 비드에 첨가하고, 4°C에서 20분 동안 인큐베이션한다. 중력 유동 컬럼으로부터 용출 분획을 수집한다(NORPA E1, 도 4B). 상기 단계를 반복하고, 용출 분획을 수집한다(NORPA E2, 도 4B).
- 용출 완충액을 사용하여, INAD/ePKC 단백질 복합체와 함께 His-태깅된 NORPA 863-1095 단편을 용출시킨다. 다음에, Ni 비드를 500 μL의 결합 완충액에 재현탁시킨다.
- 재현탁된 Ni 비드를 취하여 SDS-PAGE(쿠마시 블루 R250으로 염색)를 실행하여 용출의 효율을 분석하고 용출액이 작동하는지 평가하였다(비드, 도 4B). 필요한 재료 에 대해서는 표 4 를 참조하십시오.
4. 초파리 TRP 채널의 크기 배제 컬럼 정제
- 단백질 정제 시스템에 크기 배제 컬럼 (분석 등급)을 설치하십시오. 컬럼을 컬럼 완충액 (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 0.75 mM DDM)으로 평형화시키고, 이는 0.45 μm 필터에 의해 여과된다.
- 단계 3.14로부터의 TRP E1 및 E2 분획을 4 mL 한외여과 스핀 컬럼을 사용하여 농축시키고, 냉장 원심분리기에서 4°C에서 3,000 x g 에서 원심분리하였다.
- 컬럼 버퍼로 샘플 루프를 헹구고 샘플을 샘플 루프에 로드합니다. 샘플을 크기 배제 컬럼에 주입하고 적절한 유량 (0.5 mL / 분)으로 단백질을 용출시킵니다.
- 280 nm에서 흡수하여 표적 단백질의 피크를 확인하고 SDS-PAGE 겔을 실행하여 정제된 내인성 초파리 TRP 채널을 검출한다(도 5). 필요한 재료 에 대해서는 표 5를 참조하십시오.
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Representative Results
이 기사에서는 내인성 초파리 TRP 채널을 정제하는 단백질 정제 방법을 시연합니다 (그림 1).
먼저, 재조합 단백질 발현 및 정제가 미끼 및 경쟁자 단백질을 얻기 위해 적용된다. 이어서, GST-태깅된 TRP 1261-1275 단편을 LB 배지의 대장균 BL21 (DE3) 세포에서 발현시키고, 글루타티온 비드 및 크기 배제 컬럼을 사용하여 정제하였다 (도 2). 샘플을 쿠마시 블루 R250 염색을 사용한 SDS-PAGE 분석을 사용하여 검증하였다. SDS-PAGE 샘플 제조 공정에서, 30 μL의 단백질 샘플을 10 μL의 4x 로딩 염료와 혼합하고 100°C에서 10분 동안 비등시킨다. 이어서, 15 μL의 삶은 샘플이 각 웰에 개별적으로 로딩된다. His-태깅된 NORPA 863-1095 단편은 또한 LB 배지에서 대장균 BL21 (DE3) 세포에서 유사하게 발현되고 Ni-비드 및 크기-배제 컬럼에 의해 정제된다 (도 3). 정제된 GST-태깅된 TRP 1261-1275 및 His-태깅된 NORPA 863-1095는 내인성 초파리 TRP 채널의 정제를 위해 농축된다.
둘째, 초파리 헤드는 미리 냉각 된 모르타르 - 페슬을 사용하여 액체 질소에서 수집 및 균질화 된 다음 10x v / w 용해 버퍼에 용해됩니다 (표 4). 용해된 헤드 균질액을 4°C에서 20분 동안 진탕기에서 인큐베이션하고, 4°C에서 20분 동안 20,817 x g 에서 원심분리한다. 스핀 다운 상청액 (20817 g S, 도 4A)을 수집하고, 4°C에서 60분 동안 100,000 x g 에서 추가로 원심분리한다. 두 번째 스핀-다운 상청액(100,000 g S, 도 4A)은 후속 풀다운 분석에 사용된다.
마지막으로, 풀다운 및 경쟁 분석의 원리에 기초하여, 친화성 정제 플러스 경쟁 전략이 내인성 TRP 채널을 정제하는데 사용된다. 정제된 His-태깅된 NORPA 863-1095 단편은 Ni-비드에 결합되고 초파리 머리 균질물로부터 내인성 INAD 단백질 복합체를 끌어내리는 미끼로 사용된다. 이어서, 과도한 정제된 GST-태깅된 TRP 1261-1275 단편은 Ni 비드 상의 포획된 INAD 착물로부터의 TRP 채널에 대해 경쟁하기 위해 첨가된다(TRP E1, TRP E2, 도 4B). 결국, 용출된 TRP 채널은 크기 배제 크로마토그래피에 의해 과도한 GST 태깅된 TRP 1261-1275 펩티드로부터 분리된다(도 5). SDS-PAGE 샘플 제조 공정에서, 30 μL의 단백질 샘플을 10 μL의 4x 로딩 염료와 혼합하고 100°C에서 10분 동안 비등시킨다. 이어서, 15 μL의 샘플을 각 웰에 개별적으로 로딩한다. 부산물로서, INAD-ePKC-NORPA 863-1095 복합체는 또한 TRP 1261-1275 펩티드 경쟁 후에 Ni 비드를 용출시킴으로써 수득될 수 있다 (NORPA E1, NORAP E2, 도 4B). 이 방법을 사용하여, 0.5 g 플라이 헤드로부터의 최종 정제된 초파리 TRP 채널의 전형적인 수율은 3 μM TRP 단백질 (1.5 x 10-10 mol)의 50 μL이다. 더 많은 정제 된 TRP 채널이 필요한 경우 플라이 헤드, Ni 비드, 미끼 단백질 및 경쟁자의 양을 그에 따라 확장하십시오.
도 1: 내인성 초파리 TRP 채널의 정제를 위한 모식도. (A) 정제된 His-태깅된 NORPA 863-1095 단백질은 Ni-비드 상에 고정화된다. (B) 초파리 헤드는 균질화되고 100,000 x g 원심분리 후 스핀 다운 상청액을 NORPA-결합된 Ni-비드에 첨가하며, 여기서 NORPA 863-1095 단백질은 내인성 INAD 단백질 복합체 (INAD/TRP/ePKC)를 포획하는 미끼 역할을 한다. (c) GST-태깅된 TRP 1261-1275 단편이 포획된 INAD 단백질 복합체로부터의 내인성 초파리 TRP 채널에 대해 경쟁하기 위해 첨가된다. (d) 용출된 TRP 단백질은 과도한 GST 태깅된 TRP 1261-1275 단편을 분리하기 위해 크기 배제 컬럼에 의해 추가로 정제된다. 빨간색 화살표는 각각 TRP 채널 및 GST 태그가 지정된 TRP 1261-1275 단편의 용출 위치를 강조 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 글루타티온 비드 및 크기 배제 크로마토그래피에 의한 GST 태깅된 TRP-CT 1261-1275 단백질의 정제. (A) 크기 배제 컬럼에서 GST 태깅된 TRP-CT 1261-1275 단백질의 정제 프로파일(준비 등급). 분획은 5 mL/튜브에서 수집된다. 화살표 위치(튜브 44-48)에서의 분획은 내인성 TRP 채널의 다음의 정제를 위해 수집되고 농축된다. (b) 쿠마시 블루 R250 염색된 SDS-PAGE 겔은 글루타티온-비드 친화성 정제 및 후속 크기-배제 컬럼 정제에서 GST-태깅된 TRP 1261-1275 단편을 나타낸다. 화살표는 SDS-PAGE 겔에서 GST 태깅된 TRP 1261-1275 단편의 위치를 강조 표시한다. 약어 : P : 대장균의 펠렛. BL21(DE3) 세포 용해물을 PBS 완충액에서 균질화하고 48,384 x g에서 원심분리한 후; S: 대장균으로부터의 상청액. BL21(DE3) 세포 용해물 후 균질화 및 원심분리 후 48,384 x g; F: 유동-관통 분획 이전의 S 분획을 4°C에서 30분 동안 글루타티온 비드와 함께 인큐베이션한 후; W1 및 W2: PBS 완충액의 10 컬럼 부피에 의한 제1 및 제2 세척 분획; B: 재현탁된 글루타티온 비드 상의 용출되지 않은 단백질은 용출 효율을 평가하기 위해 SDS-PAGE 겔에 의해 분석되고; E: 용출 완충액에 의한 글루타티온 비드로부터의 용출 분획. GST 태깅된 단백질 정제를 위한 완충액 제조법은 표 1에 기재되어 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: Ni-비드 및 크기-배제 크로마토그래피에 의한 His-태깅된 NORPA 863-1095 단백질의 정제. (A) 크기 배제 컬럼에서 His-태깅된 NORPA 863-1095 단백질의 정제 프로파일. 유속 = 3 mL/분. 분획은 5 mL/튜브에서 수집된다. 화살표 위치(튜브 44-49)에서의 분획은 내인성 TRP 채널의 다음의 정제를 위해 수집되고 농축된다. (b) 쿠마시 블루 R250 염색된 SDS-PAGE 겔은 Ni 컬럼 정제 및 후속 크기-배제 컬럼 정제에서 His-태그된 NORPA 863-1095 단백질을 나타낸다. 화살표는 SDS-PAGE 겔에서 그의 태그가 붙은 NORPA 863-1095 단백질의 위치를 강조한다. 약어 : P : 대장균의 펠렛. BL21(DE3) 세포 용해물 결합 완충액에서 균질화 후 48,384 x g에서 원심분리; S: 대장균으로부터의 상청액 분획. BL21(DE3) 세포 용해물 후 균질화 및 원심분리 후 48,384 x g; F: 이전 S 분획이 4°C에서 30분 동안 Ni-비드와 함께 인큐베이션된 후의 유동-관통 분획; W1 및 W2: 세척 완충액의 10 컬럼 부피에 의한 제1 및 제2 세척 분획; B: 용출 후 재현탁된 Ni 비드 상의 용출되지 않은 단백질; E: 용출 완충액에 의한 Ni-비드로부터의 용출 분획. His-태그된 단백질 정제를 위한 완충제 레시피는 표 2에 열거되어 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 내인성 초파리 TRP 채널의 정제. 모든 단계로부터 수집된 샘플을 SDS-PAGE에 의해 분석하고, 쿠마시 블루 R-250 염료로 염색한다. (a) 20817 g S: 20,817 x g 원심분리 후 헤드 균질액의 상청액 분획; NORPA F: 그의 태그된 NORPA 863-1095 단편 결합 후 Ni-비드의 유동-관통 분획; Wash1 및 Wash2: His-태깅된 NORPA 863-1095 결합 후 용해 완충액에 의한 Ni-비드의 제1 및 제2 세척 분획; 100,000 g S: 이전의 20,817 g S 상청액을 100,000 x g 에서 추가로 원심분리하고, 상청액을 SDS-PAGE에 대해 수집하고; 드로머리 용해 F: 100,000 g S 샘플과 함께 인큐베이션한 후 Ni 비드의 유동 관통 분획; Wash3 및 Wash4: 100,000 g S 샘플로 인큐베이션한 후 용해 완충액에 의해 Ni-비드의 분획을 세척한다. (b) TRP E1 및 E2: GST에 의해 제1 및 제2 용출된 TRP 채널 분획-태깅된 TRP 1261-1275 단편; Wash5: GST 태깅된 TRP 1261-1275에 의한 경쟁 후 결합 완충액에 의한 Ni 비드의 분획 세척; NORPA E1 및 E2: 포획된 INAD/ePKC 복합체를 갖는 그의 태그된 NORPA 863-1095 단편의 제1 및 제2 용출 분획; beads: 용출 완충액 처리 후 재현탁된 Ni-비드에 머무르는 용출되지 않은 단백질. 내인성 초파리 TRP 채널 정제를 위한 완충제 제조법은 표 4에 기재되어 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 크기 배제 크로마토그래피에 의한 내인성 초파리 TRP 채널 단백질의 정제. (a) 크기-배제 컬럼에서 내인성 초파리 TRP 채널 단백질의 정제 프로파일. 유속 = 0.5 mL/분. 분획을 0.5 mL/튜브에서 수집하였다. 화살표 위치(1E8-1F2)에서 분획을 수집하고, 농축시켰다. (b) 쿠마시 블루 R-250 염색된 SDS-PAGE 겔은 크기 배제 컬럼 정제 후 내인성 초파리 TRP 채널 단백질을 나타낸다. 정제된 내인성 초파리 TRP 채널 단백질의 위치는 적색 화살표에 의해 강조된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: GST 태깅된 TRP 1261-1275 단편의 정제에 필요한 물질. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: His-태깅된 NORPA 863-1095 단편의 정제에 필요한 물질. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 3 : 초파리 머리 준비에 필요한 재료. 여기를 클릭하여이 표를 다운로드하십시오.
표 4: 초파리 TRP 채널 정제에 필요한 재료. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 5: 초파리 TRP 채널의 크기 배제 컬럼 정제에 필요한 재료. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
다섯 개의 PDZ 도메인을 포함하는 INAD는 초파리 광전달 기계의 핵심 조직자입니다. 이전의 연구는 INAD PDZ3이 절묘한 특이성(KD = 0.3 μM)18을 갖는 TRP 채널 C 말단 꼬리에 결합한다는 것을 보여주었다. INAD PDZ45 탠덤은 매우 높은 결합 친화도(KD = 30 nM)를 갖는 NORPA 863-1095 단편과 상호작용한다. 이러한 발견은 친화성 정제와 경쟁 전략을 설계하기 위한 견고한 생화학적 기반을 제공하여 NORPA CC-PBM 단편을 풀다운 미끼로 사용할 수 있게 하는 반면, TRP C 말단 꼬리(단편 1261-1275)는 경쟁 시약으로 기능합니다. 따라서, 이 방법의 첫 번째 중요한 점은 INAD 복합체의 조립 메커니즘을 이해하고 충분한 NORPA 및 TRP 단편을 얻는 것이다. 동시에, TRP 채널은 멤브레인으로부터 추출되고 용액에서 안정화되어야하는 막 단백질이기 때문에 세제의 사용은이 방법의 두 번째 중요한 포인트입니다. TRP 채널24,25의 구조 및 기능 연구를 위한 대중적인 세제로서, n-도데실-B-D-말토사이드(DDM)가 이 방법에 사용된다. 정제 결과가 만족스럽지 않으면 미끼 단백질, 경쟁 단백질 및 세제의 품질을주의 깊게 점검해야합니다. 또한, TRP 채널의 추출 효율은 TRP 항체를 이용한 웨스턴 블롯에 의해 추적될 수 있다.
이전 연구5에서, 고가의 스트렙타비딘 비드가 플라이 헤드 추출물로부터 TRP 채널을 정제하는데 사용되었으며, 이는 실험실에서의 일상적인 정제를 제한한다. 따라서, Ni-비드와 결합된 His-태깅된 NORPA 863-1095 단편을 사용하여 비용을 절감하고 수율을 증가시킴으로써 상기 방법을 개선하였다. 현재, 개선된 방법에서 정제된 TRP 채널의 수율은 투과 전자 현미경(TEM) 음성 염색 실험을 수행하기에 충분하며, 여기서 정제된 TRP 채널은 사량체(데이터 미도시)를 형성하며, 이는 정제 과정이 TRP 채널의 사량체 형성을 방해하지 않음을 나타낸다. 따라서, 이 프로토콜은 미래의 cryo-EM 및 전기생리학 실험에 잠재적으로 적합할 것이다.
그러나 실험에 사용 된 경쟁자 (NORPA 863-1095 단편, TRP 1261-1275 단편)는 야생형 단백질과 유사한 결합 친화력을 갖기 때문에이 방법의 한계는 표적 단백질을 끌어 내기 위해 대규모 경쟁 단백질 및 비드를 사용해야한다는 것입니다. 대규모로 미끼를 정화 할 수없는 실험실에서는 편리하지 않습니다.
이 방법의 잠재적 인 향후 적용은 Cryo-EM 기술을 사용하여 초파리 TRP 채널의 구조 정보를 연구하는 것입니다. 또한, 인공 이중층 지질막에서 정제된 내인성 TRP 채널의 전기생리학적 특성을 측정하는 것도 실현 가능하다. 더욱이, 이러한 재구성된 모델 시스템에서, INAD 복합체 조성물 및 지질 조성물을 조절함으로써 정제된 내인성 TRP 채널의 전기생리학적 특성을 특성화하는 것이 흥미로울 것이다. 마지막으로, 구조적 정보 및 전기생리학적 특성과 결합하여, TRP 채널의 게이팅 및 조절 메카니즘은 미래에 신중하게 검토될 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (제 31870746 호), 심천 기본 연구 보조금 (JCYJ20200109140414636) 및 중국 광동성 자연 과학 재단 (No. 2021A1515010796)이 W. L. L. 이 원고를 준비하는 동안 언어 적 도움을 주신 LetPub (www.letpub.com)에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial strains | |||
| BL21(DE3) Competent Cells | Novagen | 69450 | Protein overexpression |
| Experiment models | |||
| D.melanogaster: W1118 strain | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC:3605 | Drosophila head preparation |
| Material | |||
| 20/30/40 mesh stainless steel sieves | Jiufeng metal mesh company | GB/T6003.1 | Drosophila head preparation |
| 30% Acrylamide-N,N′-Methylenebisacrylamide(29:1) | Lablead | A3291 | SDS-PAGE gel preparation |
| Ammonium Persulfate | Invitrogen | HC2005 | SDS-PAGE gel preparation |
| Cocktail protease inhibitor | Roche | 05892953001 | Protease inhibitor |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech | A100472-0025 | SDS-PAGE gel staining |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sangon Biotech | A620058-0100 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) | Sangon Biotech | A500838-0500 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Glycine | Sangon Biotech | A610235-0005 | SDS-PAGE buffer preparation |
| Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads | Cytiva | 17513202 | Affinity chromatography |
| Imidazole | Sangon Biotech | A500529-0001 | Elution buffer preparation for Ni-column |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sangon Biotech | A600168-0025 | Induction of protein overexpression |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002-0250 | E.coli. cell culture |
| L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma-aldrich | G4251-100G | Elution buffer preparation for Glutathione beads |
| Ni-Sepharose excel beads | Cytiva | 17371202 | Affinity chromatography |
| N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM) | Sangon Biotech | A610424-001 | Detergent for protein purification |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-aldrich | T9281-100ML | SDS-PAGE gel preparation |
| PBS | Sangon Biotech | E607008-0500 | Homogenization buffer for E.coli. cell |
| PMSF | Lablead | P0754-25G | Protease inhibitor |
| Prestained protein marker | Thermo Scientific | 26619/26616 | Prestained protein ladder |
| Size exclusion column (preparation grade) | Cytiva | 28989336 | HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column |
| Size exclusion column (analytical grade) | Cytiva | 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL column |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218-0001 | Protein purification buffer preparation |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sangon Biotech | A500228-0001 | SDS-PAGE gel/buffer preparation |
| Tris base | Sigma-aldrich | T1503-10KG | Protein purification buffer preparation |
| Ultrafiltration spin column | Millipore | UFC901096/801096 | Protein concentration |
| Equipment | |||
| Analytical Balance | DENVER | APX-60 | Metage of Drosophila head |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes | Eppendorf | 5810R | Protein concentration |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes | Eppendorf | 5417R | Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm) | Bio-Rad | 738-0015 | TRP protein purification |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm) | Bio-Rad | 738-0017 | Bait and competitor protein purification from E.coli. |
| Gel Documentation System | Bio-Rad | Universal Hood II Gel Doc XR System | SDS-PAGE imaging |
| High-speed refrigerated centrifuge | Beckman coulter | Avanti J-26 XP | Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate |
| High pressure homogenizer | UNION-BIOTECH | UH-05 | Homogenization of E.coli. cells |
| Liquid nitrogen tank | Taylor-Wharton | CX-100 | Drosophila head preparation |
| Protein purification system | Cytiva | AKTA purifier | Protein purification |
| Refrigerator (-80°C) | Thermo | 900GP | Drosophila head preparation |
| Spectrophotometer | MAPADA | UV-1200 | OD600 measurement of E.coli. cells |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000c | Determination of protein concentration |
| Ultracentrifuge | Beckman coulter | Optima XPN-100 Ultracentrifuge | Ultracentrifugation |
References
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