Imaging ad autofluorescenza per valutare il metabolismo cellulare

Summary

Questo protocollo descrive l’imaging a fluorescenza e l’analisi dei coenzimi metabolici endogeni, della nicotinamide adenina ridotta (fosfato), del dinucleotide (NAD(P)H) e dell’adenina dinucleotide della flavina ossidata (FAD). L’imaging a autofluorescenza di NAD(P)H e FAD fornisce un metodo non distruttivo privo di etichette per valutare il metabolismo cellulare.

Abstract

Il metabolismo cellulare è il processo attraverso il quale le cellule generano energia e molte malattie, incluso il cancro, sono caratterizzate da un metabolismo anormale. Nicotinamide adenina (fosfato) dinucleotide (NAD(P)H) ridotta e flavina adenina dinucleotide ossidata (FAD) sono coenzimi delle reazioni metaboliche. NAD(P)H e FAD mostrano autofluorescenza e possono essere isolati spettralmente da lunghezze d’onda di eccitazione ed emissione. Entrambi i coenzimi, NAD(P)H e FAD, possono esistere in una configurazione libera o legata alle proteine, ognuno dei quali ha una durata di fluorescenza distinta, il tempo per il quale il fluoroforo rimane nello stato eccitato. L’imaging a vita di fluorescenza (FLIM) consente di quantificare l’intensità di fluorescenza e la durata di NAD(P)H e FAD per l’analisi senza etichetta del metabolismo cellulare. I microscopi a intensità di fluorescenza e durata possono essere ottimizzati per l’imaging di NAD(P)H e FAD selezionando le lunghezze d’onda di eccitazione ed emissione appropriate. Le perturbazioni metaboliche da parte del cianuro verificano i protocolli di imaging ad autofluorescenza per rilevare i cambiamenti metabolici all’interno delle cellule. Questo articolo dimostrerà la tecnica di imaging ad autofluorescenza di NAD(P)H e FAD per misurare il metabolismo cellulare.

Introduction

Il metabolismo è il processo cellulare di produzione di energia. Il metabolismo cellulare comprende più vie, tra cui glicolisi, fosforilazione ossidativa e glutaminolisi. Le cellule sane utilizzano queste vie metaboliche per generare energia per la proliferazione e la funzione, come la produzione di citochine da parte delle cellule immunitarie. Molte malattie, tra cui i disturbi metabolici, il cancro e la neurodegenerazione, sono caratterizzate da un metabolismo cellulare ^alterato1. Ad esempio, alcuni tipi di cellule tumorali hanno tassi elevati di glicolisi, anche in presenza di ossigeno, per generare molecole per la sintesi di acidi nucleici, proteine e ^lipidi2,3. Questo fenomeno, noto come effetto Warburg, è un segno distintivo di molti tipi di cancro, tra cui il cancro al seno, il cancro ai polmoni e i glioblastomi4. A causa delle alterazioni del metabolismo cellulare associate alla progressione del cancro, il metabolismo cellulare può essere un biomarcatore surrogato per la risposta ai ^farmaci5,6. Inoltre, comprendere l’efficacia del farmaco a livello cellulare è fondamentale in quanto l’eterogeneità cellulare può portare a diverse risposte farmacologiche negli ^individui7,8.

Le tecnologie che identificano e quantificano i cambiamenti nel metabolismo cellulare sono essenziali per gli studi sul cancro e sulla risposta ai farmaci. Le analisi chimiche e proteiche vengono utilizzate per valutare il metabolismo delle cellule o dei tessuti, ma mancano di risoluzione unicellulare e di informazioni spaziali. I saggi basati sul lettore di piastre metaboliche possono misurare il pH e il consumo di ossigeno nel campione nel tempo e la successiva perturbazione metabolica da parte di sostanze chimiche. Il pH può essere utilizzato per calcolare il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR), che fornisce una panoramica dell’attività glicolitica delle ^cellule9. I metodi di imaging di tutto il corpo, tra cui la tomografia a emissione di positroni fluoro-D-glucosio 2-[fluoro-18] (FDG PET) e la spettroscopia di risonanza magnetica (MRS), sono modalità di imaging non invasive utilizzate clinicamente per identificare la recidiva del tumore e l’efficacia del farmaco attraverso misurazioni metaboliche10,11,12,13,14.

FDG-PET visualizza l’assorbimento tissutale di FDG, un analogo del glucosio radiomarcato. L’aumento dell’assorbimento di FDG-PET da parte dei tumori rispetto al tessuto circostante è dovuto all’effetto ^Warburg12,13. MRS visualizza nuclei comuni di molecole utilizzate per il metabolismo, come ^13C e ^31P, e può ottenere informazioni dinamiche su come il metabolismo cambia in risposta a stimoli, come l’esercizio fisico o il ^mangiare14. Sebbene FDG-PET e MRS possano essere utilizzati clinicamente, queste tecnologie mancano della risoluzione spaziale per risolvere l’eterogeneità intratumorale. Allo stesso modo, le misurazioni del consumo di ossigeno vengono effettuate su una popolazione di massa di cellule. L’imaging a autofluorescenza supera l’ostacolo della risoluzione spaziale di queste tecnologie e fornisce un metodo non invasivo per quantificare il metabolismo cellulare.

Figura 1: NADH e FAD nelle vie metaboliche comuni. NADH e FAD sono coenzimi utilizzati nella glicolisi, nel ciclo di Krebs e nella catena di trasporto degli elettroni. L’imaging a autofluorescenza di queste molecole fornisce informazioni sul metabolismo cellulare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La nicotinamide adenina (fosfato) dinucleotide (NAD(P)H) e la flavina adenina dinucleotide ossidata (FAD) sono coenzimi delle reazioni metaboliche, tra cui glicolisi, fosforilazione ossidativa e glutaminolisi (Figura 1). Sia NAD(P)H che FAD sono autofluorescenti e forniscono un contrasto endogeno per l’imaging a fluorescenza1,15. NADPH ha proprietà fluorescenti simili a NADH. Per questo motivo, NAD(P)H è spesso usato per rappresentare il segnale combinato di NADH e ^NADPH2,16.

L’imaging a vita di fluorescenza (FLIM) quantifica la durata della fluorescenza o il tempo per il quale un fluoroforo è nello stato eccitato. Le durate di fluorescenza rispondono al microambiente dei fluorofori e forniscono informazioni sul metabolismo ^cellulare17. NAD(P)H e FAD possono esistere all’interno delle cellule in conformazioni legate a proteine o libere, ognuna delle quali ha una vita diversa. Il NAD(P)H libero ha una vita più breve rispetto al NAD(P)H legato alle proteine; al contrario, la FAD libera ha una durata maggiore rispetto alla ^FAD18,19 legata. Le durate e i pesi dei componenti a vita possono essere quantificati dai dati di decadimento della durata della fluorescenza tramite Eq. (1)²⁰:

I(t) = α ^1e-t/_τ1 + α _2e-t^/_τ2 + C (1)

Eq (1) rappresenta l’intensità di fluorescenza normalizzata in funzione del tempo. Le α ₁ e α ₂ in questa equazione rappresentano le componenti proporzionali di vita breve e lunga (α ₁+ α ₂=1), rispettivamente, _τ1 e _τ2 rappresentano rispettivamente la vita breve e lunga, e C rappresenta la luce di ^fondo7,20. La durata ponderata in ampiezza, qui rappresentata come _τm, è calcolata utilizzando Eq. (2).

τm= α _1τ1+ α _2τ2 (2)

Una vita media può essere calcolata facendo la media di “t” sul decadimento di intensità del fluoroforo, che per un decadimento bieculente è mostrato da Eq. (3)^17,21.

τ*_m= (α _1τ12+ α _2τ22)/ (α _1τ1+ α _2τ2) (3)

Un’immagine di intensità di fluorescenza può essere calcolata dall’immagine a vita integrando il decadimento della durata della fluorescenza. L’imaging a autofluorescenza è un metodo non distruttivo e privo di etichette che può essere utilizzato per caratterizzare il metabolismo delle cellule vive a una risoluzione subcellulare. Il rapporto redox ottico fornisce una metrica analogica ottica dello stato redox chimico della cellula ed è calcolato come il rapporto tra le intensità NAD(P)H e FAD. Sebbene la formula per il calcolo del rapporto redox ottico non sia standardizzata22,23,24,25, è qui definita come l’intensità di FAD sulle intensità combinate di NAD(P)H e FAD. Questa definizione viene utilizzata perché l’intensità sommata nel denominatore normalizza la metrica tra 0 e 1 e il risultato atteso dell’inibizione del cianuro è una diminuzione del rapporto redox. Le durate di fluorescenza di NAD(P)H e FAD liberi forniscono informazioni sui cambiamenti nel microambiente del solvente metabolico, tra cui pH, temperatura, vicinanza all’ossigeno e ^{osmolarità17}.

I cambiamenti nella durata di fluorescenza delle frazioni legate di NAD(P)H e FAD possono indicare l’utilizzo della via metabolica e il metabolismo specifico del ^substrato26. I pesi dei componenti possono essere interpretati per cambiamenti nella frazione libera al legato dei ^{coenzimi18,19}. Complessivamente, queste metriche quantitative di durata dell’autofluorescenza consentono l’analisi del metabolismo cellulare e l’imaging ad autofluorescenza è stato utilizzato per identificare neoplasie da tessuti ^normali27,28, caratterizzare le cellule ^{staminali29,30}, valutare la funzione delle cellule immunitarie31,32,33,34,35, misurare l’attività ^{neurologica36, 37,38} e comprensione dell’efficacia dei farmaci in tipi di cancro come il cancro al seno e il cancro della testa e del ^{collo21,39,40,41,42}. L’imaging ad autofluorescenza ad alta risoluzione può essere combinato con la segmentazione dell’immagine per l’analisi di singole cellule e la quantificazione dell’eterogeneità intrapopolazione43,44,45,46,47.

NAD(P)H e FAD possono essere ripresi su microscopi a fluorescenza a fotone singolo o multifotone configurati per l’imaging di intensità o durata. Per i microscopi a singolo fotone, NAD(P)H e FAD sono tipicamente eccitati a lunghezze d’onda di 375-405 nm e 488 nm, rispettivamente, a causa di sorgenti laser comuni a queste lunghezze ^d’onda48. Nell’eccitazione a fluorescenza a due fotoni, NAD(P)H e FAD ecciteranno a lunghezze d’onda di circa 700-750 nm e da 700 a 900 nm, ^{rispettivamente15,49}. Una volta che i fluorofori sono eccitati, NAD(P)H e FAD emettono fotoni a lunghezze d’onda comprese tra ~ 410 nm a ~ 490 nm e ~ 510 nm a ~ 640 nm, ^{rispettivamente15}. Le lunghezze d’onda massime di emissione NAD(P)H e FAD sono rispettivamente di circa 450 nm e 535 ^nm48.

A causa delle loro diverse lunghezze d’onda di eccitazione ed emissione, la fluorescenza dei due coenzimi metabolici può essere isolata spettralmente. Una comprensione delle caratteristiche spettrali di NAD(P)H e FAD è necessaria per la progettazione e l’ottimizzazione dei protocolli di imaging ad autofluorescenza. Il cianuro è un inibitore iv del complesso della catena di trasporto degli elettroni (ETC). Gli effetti del cianuro sul metabolismo cellulare e le intensità di autofluorescenza e la durata di vita di NAD(P)H e FAD all’interno delle cellule sono ben ^{caratterizzati27,40}. Pertanto, un esperimento di perturbazione al cianuro è un mezzo efficace per convalidare i protocolli di imaging NAD(P)H e FAD. Un esperimento di cianuro di successo fornisce la certezza che il protocollo di imaging NAD(P)H e FAD può essere utilizzato per valutare il metabolismo di gruppi sconosciuti o perturbazioni.

Protocol

1. Placcatura cellulare per l’imaging Aspirare il mezzo da un pallone T-75 confluente all’80-90% di cellule MCF-7, sciacquare le cellule con 10 ml di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) e aggiungere 2 ml di tripsina allo 0,25% (1x) per staccare le cellule dal fondo del pallone. Incubare il matraccio a 37 °C per ~4 min. Controllare le cellule al microscopio per confermare il distacco. Aggiungere immediatamente 8 ml di terreno di coltura per disattivare la tr…

Representative Results

La linea cellulare epiteliale del cancro al seno, MCF-7, è stata coltivata in DMEM integrata con il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l’1% di penicillina-streptomicina. Per l’imaging a fluorescenza, le cellule sono state seminate a una densità di 4 × 105 cellule per piatto di imaging con fondo di vetro da 35 mm 48 ore prima dell’imaging. Le cellule sono state fotografate prima e dopo il trattamento con cianuro utilizzando i protocolli sopra indicati. L’obiettivo dell’esperimento al cianuro è confermare l’…

Discussion

L’intensità di autofluorescenza e l’imaging a vita sono stati ampiamente utilizzati per valutare il metabolismo nelle ^cellule21,55. FLIM è ad alta risoluzione e quindi risolve singole cellule, che è importante per gli studi sul cancro perché l’eterogeneità cellulare contribuisce all’aggressività tumorale e alla resistenza ai farmaci7,39,41,44,45,46,58.<s…

Materials

2-deoxy-d-glucose (2-DG)	Sigma	AC111980000; AC111980010; AC111980050; AC111980250
Antibiotic Antimicrobial (pen-strep)	Gibco	15240096
Cell Samples	American Type Culture Collection	N/A	MCF-7 cancer line
CellProfiler	Broad Institute	N/A	Image analysis software
Conical Tube	VWR	89039-664	15 mL conical tube
DMEM	ThermoFisher	11965092	Culture media
FAD dichroic mirror	Semrock	FF495-Di03-25×36	495 nm
FAD emission filter	Semrock	FF01-550/88-25	550/88 nm
FAD excitation filter	Semrock	FF01-458/64-25	458/64 nm
FBS	ThermoFisher	16000036
Fluorescence Lifetime Microscope	3i	N/A
Glass bottom dish	MatTek Corp	P35G-1.0-14-C
Multiphoton Laser	Coherent	N/A	2P Coherent Laser, Tunable 680 nm-1080 nm
NAD(P)H dichroic mirror	Semrock	FF409-Di03-25×36	409 nm
NAD(P)H emission filter	Semrock	FF02-447/60-25	447/60 nm
NAD(P)H excitation filter	Semrock	FF01-357/44-25	357/44 nm
PBS	ThermoFisher	70011044
Potassium Cyanide	Sigma-Aldrich	380970
SlideBooks 6	3i	N/A	Image acquisition software
SPCImage	Becker & Hickl GmbH	N/A	Fluorescence lifetime analysis software
Stage Top Incubator	okoLab	N/A
Trypsin	Biosciences	786-262
Urea	Sigma-Aldrich	U5128
YG beads	Polysciences	19096-2	Yg microspheres (20.0 µm)