Karakterisering af blodudvækstendotelceller (BOEC) fra perifert blod fra svin

Abstract

Endotelet er en dynamisk integreret struktur, der spiller en vigtig rolle i mange fysiologiske funktioner såsom angiogenese, hæmostase, inflammation og homeostase. Endotelet spiller også en vigtig rolle i patofysiologier som aterosklerose, hypertension og diabetes. Endotelceller danner den indre foring af blod og lymfekar og viser heterogenitet i struktur og funktion. Forskellige grupper har evalueret funktionaliteten af endotelceller afledt af humant perifert blod med fokus på endotelstamceller afledt af hæmatopoietiske stamceller eller modne blodudvækstendotelceller (eller endotelkolonidannende celler). Disse celler giver en autolog ressource til terapi og sygdomsmodellering. Xenogene celler kan udgøre en alternativ kilde til behandling på grund af deres tilgængelighed og homogenitet opnået ved anvendelse af genetisk lignende dyr opdrættet under lignende forhold. Derfor er der fremlagt en robust protokol til isolering og udvidelse af stærkt proliferativ blodudvækstendotelceller fra perifert blod fra svin. Disse celler kan bruges til adskillige applikationer såsom kardiovaskulær vævsteknik, celleterapi, sygdomsmodellering, lægemiddelscreening, undersøgelse af endotelcellebiologi og in vitro-cokulturer for at undersøge inflammatoriske og koagulationsresponser i xenotransplantation.

Introduction

Endotelet er en meget kompleks, dynamisk struktur og en vital bestanddel af vaskulærvæggen. Det linjer den indre overflade af blodkar for at give en fysisk grænseflade mellem cirkulerende blod og omgivende væv. Denne heterogene struktur er kendt for at udføre forskellige funktioner såsom angiogenese, inflammation, vasoregulering og hæmostase 1,2,3,4. Humane navlestrengendototelceller er en bredt undersøgt celletype for at vurdere funktionaliteten af endotelceller. Den patientspecifikke batchvariabilitet, inkonsekvente fænotype og minimale opdelingseffektivitet antyder imidlertid et behov for at bestemme en cellekilde, der kan forbedre alle disse funktioner⁵.

Det kan være teknisk udfordrende at opnå en homogen population af primære endotelceller, og primære endotelceller har ikke høj proliferativ kapacitet⁶. For at studere vaskulær regenerering og evaluere patofysiologiske processer har forskellige grupper derfor forsøgt at opnå og vurdere forskellige typer endotelceller afledt af perifert blod, fx endotelstamceller (EPC’er) eller blodudvækstendotelceller (BOEC’er)6,7,8,9 . De spindelformede tidlige EPC’er stammer fra hæmatopoietiske stamceller (HSC’er) og har begrænset vækststyrke og begrænset angiogen evne til at producere modne endotelceller. Desuden ligner de meget inflammatoriske monocytter. Derudover er deres evne til yderligere at differentiere sig til funktionelle, prolifererende, modne endotelceller stadig diskutabel 6,7,9,10. Den kontinuerlige dyrkning af mononukleære celler i perifert blod (PBMC’er) kan give anledning til en sekundær population af celler kendt som EPC’er med sen udvækst, BOEC’er eller endotelkolonidannende celler (ECFC’er)6,7,9,10. Medina et al. anerkendte i 2018 begrænsningerne ved EPC’er, tvetydigheden i deres nomenklatur sammen med en generel mangel på overensstemmelse med mange forskellige celletyper, der kontinuerligt grupperes under EPC’er¹¹. I modsætning hertil er BOEC’er blevet anerkendt for deres rolle i vaskulær reparation, sundhed og sygdom og celleterapi. Yderligere undersøgelse og terapeutisk anvendelse af disse celler vil stole på protokoller for konsekvent at udlede disse celletyper fra cirkulerende stamceller.

Primære celler såsom BOEC’er kan bruges som surrogat for at opnå stærkt proliferative modne endotelceller⁶. BOEC’er adskiller sig fænotypisk fra tidlige EPC’er og udviser typiske endotelegenskaber såsom brostensmorfologi og ekspression af adhærenskryds og caveolae¹². Genprofilering af Hebbel et al.13,14,15 viste, at BOEC’er eller ECFC’er er de sande endotelceller^, da de fremmer mikrovaskulær og dannelse af store kar. Således kan BOEC’er bruges som et værktøj til at evaluere patofysiologiske processer og genetisk variation¹⁶. De betragtes også som en fremragende cellekilde til celleterapi til vaskulær regenerering¹⁷. Derfor er en standardiseret protokol til konsekvent at udlede disse stærkt proliferative celler afgørende.

Mens BOEC’er giver et effektivt værktøj til at studere menneskelig patofysiologisk og genetisk variation, kan en mere homogen kilde til BOEC’er give mere robuste og pålidelige eksperimentelle og terapeutiske resultater. Overlegen homogenitet kan opnås ved at anvende xenogene cellekilder fra genetisk lignende dyr, der er opdrættet under lignende forhold¹⁸. Mens xenogene cellekilder er tilbøjelige til at fremkalde et værtsimmunrespons, udvikles immunmodulationsstrategier med det formål at generere immunkompatible dyr og animalske produkter, herunder celler. Især svin er en rigelig kilde til perifert blod og bruges almindeligvis til at studere medicinsk udstyr og andre terapier på grund af anatomiske og fysiologiske ligheder med mennesker. Derfor forfiner denne undersøgelse protokollen til isolering og udvidelse af stærkt proliferative BOEC’er fra perifert blod fra svin. Protokollen beskrevet nedenfor er en ligetil og pålidelig metode til at opnå et stort antal BOEC’er fra et relativt lille volumen blod. Kulturerne kan udvides gennem flere passager for at generere millioner af celler fra en enkelt blodprøve.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af de respektive Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) ved Medical College of Wisconsin og Mayo Clinic. BEMÆRK: I denne undersøgelse blev Yorkshire/Landrace/Duroc krydsende tamsvin (Sus domesticus), han og hun, 40-80 kg, 3-6 måneder gamle, anvendt. 1. Indsamling af perifert blod fra svin Forbered materialer.Heparinopløsningen fortyndes til 100 E/ml i sterilt saltvand. …

Representative Results

Morfologi af de dyrkede celler blev observeret fra kulturens start, indtil BOEC-kolonier blev observeret (figur 1). En mindre population af vedhængende celler begyndte at binde sig til kulturskålene og vokse, mens ikke-klæbende celler blev fjernet med ændringer i dyrkningsmediet (figur 1B). Kolonier optrådte først på dag 6 som en samling endotellignende celler, der spredte sig radialt udad fra et centralt punkt (figur 1D). Ef…

Discussion

BOEC’er er et kraftfuldt værktøj, der kan bruges i forskellige videnskabelige og terapeutiske tilgange ^7,8,16. BOEC’er er blevet brugt til at analysere EC-genekspression for at belyse de nøglefaktorer, der er ansvarlige for udviklingen af vaskulære sygdomme og kræft 5,19,20,21. BOEC’er er også bl…

Materials

19 G needle	Covidien	1188818112
50 mL conical tubes	Corning	352098
6 well plate	BD Falcon	353046
60 mL syringes	Covidien	8881560125
Ammonium chloride solution (0.8%)	Stemcell Technologies	07850
Antibiotic/antimycotic solution (100x)	Gibco	15240-062
Centrifuge	Thermo Scientific	75-253-839
EGM-2 culture medium	Lonza Walkersville	CC-3162
Extension tube	Hanna Pharmaceutical Supply Co.	03382C6227
Fetal bovine serum (FBS)	Atlas Biologicals	F-0500-A
Ficoll-Paque 1077	Cytiva	17144003	Density gradient solution
Heparin sodium injection (1,000 units/mL)	Pfizer	00069-0058-01
Human plasma fibronectin	Gibco	33016-015
Ice	N/A	N/A
Phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	10010-023
Pipette set	Eppendorf	2231300004
Sterile water	Gibco	15230-162
Thin pipette	Celltreat Scientific	229280