Caractérisation des cellules endothéliales de croissance sanguine (BOEC) à partir du sang périphérique porcin
Abstract
L’endothélium est une structure intégrée dynamique qui joue un rôle important dans de nombreuses fonctions physiologiques telles que l’angiogenèse, l’hémostase, l’inflammation et l’homéostasie. L’endothélium joue également un rôle important dans les physiopathologies telles que l’athérosclérose, l’hypertension et le diabète. Les cellules endothéliales forment la paroi interne des vaisseaux sanguins et lymphatiques et présentent une hétérogénéité dans la structure et la fonction. Divers groupes ont évalué la fonctionnalité des cellules endothéliales dérivées du sang périphérique humain en mettant l’accent sur les cellules progénitrices endothéliales dérivées de cellules souches hématopoïétiques ou de cellules endothéliales à excroissance sanguine mature (ou cellules formant des colonies endothéliales). Ces cellules fournissent une ressource autologue pour la thérapeutique et la modélisation des maladies. Les cellules xénogéniques peuvent constituer une autre source thérapeutique en raison de leur disponibilité et de leur homogénéité obtenues en utilisant des animaux génétiquement similaires élevés dans des conditions similaires. Par conséquent, un protocole robuste pour l’isolement et l’expansion des cellules endothéliales de croissance sanguine hautement proliférative à partir du sang périphérique porcin a été présenté. Ces cellules peuvent être utilisées pour de nombreuses applications telles que l’ingénierie tissulaire cardiovasculaire, la thérapie cellulaire, la modélisation de maladies, le criblage de médicaments, l’étude de la biologie cellulaire endothéliale et les co-cultures in vitro pour étudier les réponses inflammatoires et de coagulation dans la xénotransplantation.
Introduction
L’endothélium est une structure dynamique très complexe et un composant vital de la paroi vasculaire. Il tapisse la surface interne des vaisseaux sanguins pour fournir une interface physique entre le sang circulant et les tissus environnants. Cette structure hétérogène est connue pour remplir diverses fonctions telles que l’angiogenèse, l’inflammation, la vasorégulation et l’hémostase 1,2,3,4. Les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine sont un type de cellule largement étudié pour évaluer la fonctionnalité des cellules endothéliales. Cependant, la variabilité des lots spécifique au patient, le phénotype incohérent et l’efficacité minimale de fractionnement suggèrent la nécessité de déterminer une source cellulaire qui pourrait améliorer toutes ces caractéristiques5.
L’obtention d’une population homogène de cellules endothéliales primaires peut être techniquement difficile, et les cellules endothéliales primaires ne possèdent pas une capacité proliférative élevée6. Par conséquent, pour étudier la régénération vasculaire et évaluer les processus physiopathologiques, divers groupes ont tenté d’obtenir et d’évaluer différents types de cellules endothéliales dérivées du sang périphérique, par exemple les cellules progénitrices endothéliales (CPE) ou les cellules endothéliales à excroissance sanguine (BOEC)6,7,8,9 . Les premiers CPE en forme de fuseau proviennent de cellules souches hématopoïétiques (CSH) et ont un pouvoir de croissance limité et une capacité angiogénique limitée à produire des cellules endothéliales matures. De plus, ils ressemblent beaucoup aux monocytes inflammatoires. De plus, leur capacité à se différencier davantage en cellules endothéliales fonctionnelles, proliférantes et matures est encore discutable 6,7,9,10. La culture continue de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) peut donner naissance à une population secondaire de cellules appelées EPC à croissance tardive, BOEC ou cellules endothéliales formant colonies (ECFC)6,7,9,10. Medina et al. en 2018, ont reconnu les limites des CPE, l’ambiguïté de leur nomenclature, ainsi qu’un manque général de concordance avec de nombreux types de cellules distinctes continuellement regroupés sous EPC11. En revanche, les BOEC sont reconnus pour leur rôle dans la réparation vasculaire, la santé et la maladie, et la thérapie cellulaire. D’autres études et l’utilisation thérapeutique de ces cellules reposeront sur des protocoles visant à dériver systématiquement ces types de cellules à partir de cellules progénitrices circulantes.
Les cellules primaires telles que les BOEC peuvent être utilisées comme substitut pour obtenir des cellules endothéliales matures hautement prolifératives6. Les BOEC sont phénotypiquement distinctes des premiers EPC et présentent des caractéristiques endothéliales typiques telles que la morphologie pavée et l’expression des jonctions adhérentes et des cavéoles12. Le profilage génétique par Hebbel et al.13,14,15 a révélé que les BOEC ou ECFC sont les véritables cellules endothéliales car elles favorisent la formation de microvasculaires et de gros vaisseaux. Ainsi, les BOEC peuvent être utilisés comme un outil pour évaluer les processus physiopathologiques et la variation génétique16. Ils sont également considérés comme une excellente source cellulaire pour la thérapie cellulaire pour la régénération vasculaire17. Par conséquent, un protocole standardisé pour dériver de manière cohérente ces cellules hautement prolifératives est essentiel.
Alors que les BOEC fournissent un outil puissant pour étudier les variations physiopathologiques et génétiques humaines, une source plus homogène de BOEC peut fournir des résultats expérimentaux et thérapeutiques plus robustes et fiables. Une homogénéité supérieure peut être obtenue en utilisant des sources de cellules xénogéniques dérivées d’animaux génétiquement similaires élevés dans des conditions similaires18. Alors que les sources de cellules xénogéniques sont susceptibles de provoquer une réponse immunitaire de l’hôte, des stratégies d’immunomodulation sont en cours d’élaboration dans le but de générer des animaux et des produits animaux immunocompatibles, y compris des cellules. Les porcs, en particulier, sont une source abondante de sang périphérique et sont couramment utilisés pour étudier les dispositifs médicaux et autres thérapies en raison de similitudes anatomiques et physiologiques avec les humains. Par conséquent, cette étude affine le protocole pour l’isolement et l’expansion des BOEC hautement prolifératifs à partir du sang périphérique porcin. Le protocole détaillé ci-dessous est une méthode simple et fiable pour obtenir un grand nombre de BOEC à partir d’un volume de sang relativement faible. Les cultures peuvent être étendues à travers plusieurs passages pour générer des millions de cellules à partir d’un seul échantillon de sang.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les BOEC sont un outil puissant qui peut être utilisé dans diverses approches scientifiques et thérapeutiques 7,8,16. Les BOEC ont été utilisés pour analyser l’expression des gènes EC afin d’élucider les facteurs clés responsables du développement des maladies vasculaires et du cancer 5,19,20,21.<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs souhaitent remercier le financement du NIH/NHLBI R00 HL129068.
Materials
| 19 G needle | Covidien | 1188818112 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 352098 | |
| 6 well plate | BD Falcon | 353046 | |
| 60 mL syringes | Covidien | 8881560125 | |
| Ammonium chloride solution (0.8%) | Stemcell Technologies | 07850 | |
| Antibiotic/antimycotic solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75-253-839 | |
| EGM-2 culture medium | Lonza Walkersville | CC-3162 | |
| Extension tube | Hanna Pharmaceutical Supply Co. | 03382C6227 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Ficoll-Paque 1077 | Cytiva | 17144003 | Density gradient solution |
| Heparin sodium injection (1,000 units/mL) | Pfizer | 00069-0058-01 | |
| Human plasma fibronectin | Gibco | 33016-015 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Pipette set | Eppendorf | 2231300004 | |
| Sterile water | Gibco | 15230-162 | |
| Thin pipette | Celltreat Scientific | 229280 |
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