Характеристика эндотелиальных клеток разрастания крови (BOEC) из периферической крови свиней
Abstract
Эндотелий представляет собой динамическую интегрированную структуру, которая играет важную роль во многих физиологических функциях, таких как ангиогенез, гемостаз, воспаление и гомеостаз. Эндотелий также играет важную роль в патофизиологии, такой как атеросклероз, гипертония и диабет. Эндотелиальные клетки образуют внутреннюю оболочку кровеносных и лимфатических сосудов и проявляют гетерогенность в структуре и функциях. Различные группы оценивали функциональность эндотелиальных клеток, полученных из периферической крови человека, уделяя особое внимание эндотелиальным клеткам-предшественникам, полученным из гемопоэтических стволовых клеток или зрелых эндотелиальных клеток крови (или эндотелиальных колониеобразующих клеток). Эти клетки обеспечивают аутологичный ресурс для терапии и моделирования заболеваний. Ксеногенные клетки могут обеспечить альтернативный источник терапевтических средств из-за их доступности и однородности, достигаемой с помощью генетически сходных животных, выращенных в аналогичных условиях. Таким образом, был представлен надежный протокол выделения и расширения эндотелиальных клеток с высоким пролиферативным ростом крови из периферической крови свиней. Эти клетки могут быть использованы для многочисленных применений, таких как сердечно-сосудистая тканевая инженерия, клеточная терапия, моделирование заболеваний, скрининг лекарств, изучение биологии эндотелиальных клеток и совместные культуры in vitro для исследования воспалительных и коагуляционных реакций при ксенотрансплантации.
Introduction
Эндотелий представляет собой очень сложную, динамичную структуру и жизненно важный компонент сосудистой стенки. Он выстилает внутреннюю поверхность кровеносных сосудов, обеспечивая физический интерфейс между циркулирующей кровью и окружающими тканями. Известно, что эта гетерогенная структура выполняет различные функции, такие как ангиогенез, воспаление, вазорегуляция и гемостаз 1,2,3,4. Эндотелиальные клетки пупочной вены человека являются широко изученным типом клеток для оценки функциональности эндотелиальных клеток. Тем не менее, вариабельность партии для конкретного пациента, непоследовательный фенотип и минимальная эффективность расщепления предполагают необходимость определения источника клеток, который мог бы улучшить все эти особенности5.
Получение однородной популяции первичных эндотелиальных клеток может быть технически сложным, а первичные эндотелиальные клетки не обладают высокой пролиферативной способностью6. Следовательно, для изучения регенерации сосудов и оценки патофизиологических процессов различные группы пытались получить и оценить различные типы эндотелиальных клеток, полученных из периферической крови, например, эндотелиальные клетки-предшественники (EPC) или эндотелиальные клетки роста крови (BOEC)6,7,8,9 . Веретенообразные ранние ЭПК происходят из гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и имеют ограниченную потенциал роста и ограниченную ангиогенную способность продуцировать зрелые эндотелиальные клетки. Кроме того, они очень похожи на воспалительные моноциты. Кроме того, их способность к дальнейшей дифференцировке в функциональные, пролиферирующие, зрелые эндотелиальные клетки все еще остается спорной 6,7,9,10. Непрерывная культура мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) может привести к образованию вторичной популяции клеток, известных как EPC с поздним ростом, BOEC или эндотелиальные колониеобразующие клетки (ECFC)6,7,9,10. Medina et al. в 2018 году признали ограничения EPC, неоднозначность их номенклатуры, а также общее отсутствие соответствия со многими различными типами клеток, постоянно группируемыми под EPC11. Напротив, BOEC получили признание за их роль в восстановлении сосудов, здоровье и болезни, а также клеточную терапию. Дальнейшее изучение и терапевтическое использование этих клеток будет основываться на протоколах для последовательного получения этих типов клеток из циркулирующих клеток-предшественников.
Первичные клетки, такие как BOEC, могут быть использованы в качестве суррогата для получения высокопролиферативных зрелых эндотелиальных клеток6. BOEC фенотипически отличаются от ранних EPC и демонстрируют типичные эндотелиальные особенности, такие как морфология булыжника и экспрессия прилипших соединений и кавеол12. Профилирование генов, проведенное Hebbel et al.13,14,15, показало, что BOEC или ECFC являются истинными эндотелиальными клетками, поскольку они способствуют образованию микрососудов и крупных сосудов. Таким образом, BOEC могут быть использованы в качестве инструмента для оценки патофизиологических процессов и генетической изменчивости16. Они также считаются отличным источником клеток для клеточной терапии для регенерации сосудов17. Следовательно, стандартизированный протокол для последовательного получения этих высокопролиферативных клеток имеет важное значение.
В то время как BOEC предоставляют мощный инструмент для изучения патофизиологических и генетических вариаций человека, более однородный источник BOEC может обеспечить более надежные и надежные экспериментальные и терапевтические результаты. Превосходная однородность может быть достигнута за счет использования ксеногенных клеточных источников, полученных от генетически сходных животных, выращенных в аналогичных условиях18. В то время как ксеногенные клеточные источники склонны вызывать иммунный ответ хозяина, разрабатываются стратегии иммуномодуляции с целью получения иммуносовместимых животных и продуктов животного происхождения, включая клетки. Свиньи, в частности, являются обильным источником периферической крови и обычно используются для изучения медицинских устройств и других методов лечения из-за анатомического и физиологического сходства с людьми. Следовательно, это исследование уточняет протокол выделения и распространения высокопролиферативных BOEC из периферической крови свиней. Протокол, подробно описанный ниже, является простым и надежным методом получения большого количества BOEC из относительно небольшого объема крови. Культуры могут быть расширены через несколько проходов для получения миллионов клеток из одного образца крови.
Protocol
Representative Results
Discussion
BOEC являются мощным инструментом, который может быть использован в различных научных и терапевтических подходах 7,8,16. BOEC были использованы для анализа экспрессии гена EC для выяснения ключевых факторов, ответственных за развитие сосуди?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы выразить признательность за финансирование со стороны NIH/NHLBI R00 HL129068.
Materials
| 19 G needle | Covidien | 1188818112 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 352098 | |
| 6 well plate | BD Falcon | 353046 | |
| 60 mL syringes | Covidien | 8881560125 | |
| Ammonium chloride solution (0.8%) | Stemcell Technologies | 07850 | |
| Antibiotic/antimycotic solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75-253-839 | |
| EGM-2 culture medium | Lonza Walkersville | CC-3162 | |
| Extension tube | Hanna Pharmaceutical Supply Co. | 03382C6227 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Ficoll-Paque 1077 | Cytiva | 17144003 | Density gradient solution |
| Heparin sodium injection (1,000 units/mL) | Pfizer | 00069-0058-01 | |
| Human plasma fibronectin | Gibco | 33016-015 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Pipette set | Eppendorf | 2231300004 | |
| Sterile water | Gibco | 15230-162 | |
| Thin pipette | Celltreat Scientific | 229280 |
References
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds. Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms. Circulation Research. 100 (2), 158-173 (2007).
- Pober, J. S., Tellides, G. Participation of blood vessel cells in human adaptive immune responses. Trends in Immunology. 33 (1), 49-57 (2012).
- Navarro, S., et al. The endothelial cell protein C receptor: its role in thrombosis. Thrombosis Research. 128 (5), 410-416 (2011).
- Hasstedt, S. J., et al. Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis. Blood. 114 (14), 3084-3091 (2009).
- Ormiston, M. L., et al. Generation and culture of blood outgrowth endothelial cells from human peripheral blood. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53384 (2015).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. Journal of Clinical Investigation. 105 (1), 71-77 (2000).
- Martin-Ramirez, J., Hofman, M., Biggelaar, M. V. D., Hebbel, R. P., Voorberg, J. Establishment of outgrowth endothelial cells from peripheral blood. Nature Protocols. 7 (9), 1709-1715 (2012).
- Gulati, R., et al. Diverse origin and function of cells with endothelial phenotype obtained from adult human blood. Circulation Research. 93 (11), 1023-1025 (2003).
- Hebbel, R. P. Blood endothelial cells: utility from ambiguity. The Journal of Clinical Investigation. 127 (5), 1613-1615 (2017).
- Medina, R. J., et al. Endothelial progenitors: A consensus statement on nomenclature. Stem Cells Translational Medicine. 6 (5), 1316-1320 (2018).
- Medina, R. J., et al. Molecular analysis of endothelial progenitor cell (EPC) subtypes reveals two distinct cell populations with different identities. BMC Medical Genomics. 3, 18 (2010).
- Jiang, A., Pan, W., Milbauer, L. C., Shyr, Y., Hebbel, R. P. A practical question based on cross-platform microarray data normalization: are BOEC more like large vessel or microvascular endothelial cells or neither of them. Journal of Bioinformatics and Computational Biology. 5 (4), 875-893 (2007).
- Pan, W., Shen, X., Jiang, A., Hebbel, R. P. Semi-supervised learning via penalized mixture model with application to microarray sample classification. Bioinformatics. 22 (19), 2388-2395 (2006).
- Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (9), 1584-1595 (2008).
- Fernandez, L. A., et al. Blood outgrowth endothelial cells from hereditary haemorrhagic telangiectasia patients reveal abnormalities compatible with vascular lesions. Cardiovascular Research. 68 (2), 235-248 (2005).
- Critser, P. J., Yoder, M. C. Endothelial colony-forming cell role in neoangiogenesis and tissue repair. Current Opinion in Organ Transplantation. 15 (1), 68-72 (2010).
- Zhao, Y., et al. Isolation and culture of primary aortic endothelial cells from miniature pigs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59673 (2019).
- Chang Milbauer, L., et al. Genetic endothelial systems biology of sickle stroke risk. Blood. 111 (7), 3872-3879 (2008).
- Wei, P., et al. Differential endothelial cell gene expression by African Americans versusCaucasian Americans: a possible contribution to health disparity in vascular disease and cancer. BMC Medicine. 9 (1), 2 (2011).
- Hasstedt, S. J., et al. Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 114 (14), 3084-3091 (2009).
- Milbauer, L. C., et al. Blood outgrowth endothelial cell migration and trapping in vivo: a window into gene therapy. Translational Research. 153 (4), 179-189 (2009).
- Matsui, H., et al. Ex vivo gene therapy for hemophilia A that enhances safe delivery and sustained in vivo factor VIII expression from lentivirally engineered endothelial progenitors. Stem Cells. 25 (10), 2660-2669 (2007).
- De Meyer, S. F., et al. Phenotypic correction of von Willebrand disease type 3 blood-derived endothelial cells with lentiviral vectors expressing von Willebrand factor. Blood. 107 (12), 4728-4736 (2006).
- Bodempudi, V., et al. Blood outgrowth endothelial cell-based systemic delivery of antiangiogenic gene therapy for solid tumors. Cancer Gene Therapy. 17 (12), 855-863 (2010).
- Dudek, A. Z., et al. Systemic inhibition of tumour angiogenesis by endothelial cell-based gene therapy. British Journal of Cancer. 97 (4), 513-522 (2007).
- Moubarik, C., et al. Transplanted late outgrowth endothelial progenitor cells as cell therapy product for stroke. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (1), 208-220 (2011).
- Pislaru Sorin, V., et al. Magnetic forces enable rapid endothelialization of synthetic vascular grafts. Circulation. 114 (1), 314 (2006).
- Satyananda, V., et al. New concepts of immune modulation in xenotransplantation. Transplantation. 96 (11), 937-945 (2013).
- Klymiuk, N., Aigner, B., Brem, G., Wolf, E. Genetic modification of pigs as organ donors for xenotransplantation. Molecular Reproduction and Development. 77 (3), 209-221 (2010).
- Ryczek, N., Hryhorowicz, M., Zeyland, J., Lipiński, D., Słomski, R. CRISPR/Cas technology in pig-to-human xenotransplantation research. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 3196 (2021).
- Cooper, D. K., Koren, E., Oriol, R. Genetically engineered pigs. Lancet. 342 (8872), 682-683 (1993).
- Cozzi, E., White, D. J. G. The generation of transgenic pigs as potential organ donors for humans. Nature Medicine. 1 (9), 964-966 (1995).
- Phelps, C. J., et al. Production of alpha 1,3-galactosyltransferase-deficient pigs. Science. 299 (5605), 411-414 (2003).
