Karakterisering av endotelceller fra blodutvekst (BOEC) fra perifert blodblod fra svin

Abstract

Endotelet er en dynamisk integrert struktur som spiller en viktig rolle i mange fysiologiske funksjoner som angiogenese, hemostase, betennelse og homeostase. Endotelet spiller også en viktig rolle i patofysiologier som aterosklerose, hypertensjon og diabetes. Endotelceller danner den indre foringen av blod og lymfekar og viser heterogenitet i struktur og funksjon. Ulike grupper har evaluert funksjonaliteten til endotelceller avledet fra humant perifert blod med fokus på endoteliale stamceller avledet fra hematopoietiske stamceller eller modne endotelceller fra blodutvekst (eller endotelkolonidannende celler). Disse cellene gir en autolog ressurs for terapeutikk og sykdomsmodellering. Xenogene celler kan gi en alternativ kilde til terapi på grunn av deres tilgjengelighet og homogenitet oppnådd ved bruk av genetisk lignende dyr oppdratt under lignende forhold. Derfor har en robust protokoll for isolering og utvidelse av svært proliferative endotelceller fra svinekjøtt perifert blod blitt presentert. Disse cellene kan brukes til mange applikasjoner som kardiovaskulær vevsteknikk, celleterapi, sykdomsmodellering, legemiddelscreening, studier av endotelcellebiologi og in vitro-kokulturer for å undersøke inflammatoriske og koagulasjonsresponser ved xenotransplantasjon.

Introduction

Endotelet er en svært kompleks, dynamisk struktur og en viktig komponent i vaskulærveggen. Den linjer den indre overflaten av blodkar for å gi et fysisk grensesnitt mellom sirkulerende blod og omkringliggende vev. Denne heterogene strukturen er kjent for å utføre forskjellige funksjoner som angiogenese, betennelse, vasoregulering og hemostase 1,2,3,4. Humane endotelceller i navlestrengen er en mye studert celletype for å vurdere funksjonaliteten til endotelceller. Imidlertid antyder den pasientspesifikke batchvariabiliteten, inkonsekvent fenotype og minimal splittingseffektivitet et behov for å bestemme en cellekilde som kan forbedre alle disse funksjonene⁵.

Å oppnå en homogen populasjon av primære endotelceller kan være teknisk utfordrende, og primære endotelceller har ikke høy proliferativ kapasitet⁶. Derfor, for å studere vaskulær regenerering og evaluere patofysiologiske prosesser, har ulike grupper forsøkt å skaffe og vurdere forskjellige typer endotelceller avledet fra perifert blod, for eksempel endoteliale stamceller (EPC) eller endotelceller fra blodutvekst (BOECs)6,7,8,9 . De spindelformede tidlige EPC-ene stammer fra hematopoietiske stamceller (HSC) og har begrenset vekststyrke og begrenset angiogen evne til å produsere modne endotelceller. Videre ligner de på inflammatoriske monocytter. I tillegg er deres evne til ytterligere å differensiere til funksjonelle, prolifererende, modne endotelceller fortsatt diskutabel 6,7,9,10. Den kontinuerlige kulturen av mononukleære celler i perifert blod (PBMC) kan gi opphav til en sekundær populasjon av celler kjent som EPC med sen utvekst, BOEC eller endotelkolonidannende celler (ECFC)6,7,9,10. Medina et al. i 2018, anerkjente begrensningene til EPC, tvetydigheten i deres nomenklatur, sammen med en generell mangel på samsvar med mange forskjellige celletyper kontinuerlig gruppert under EPC¹¹. I motsetning til dette har BOECs blitt anerkjent for sin rolle i vaskulær reparasjon, helse og sykdom og celleterapi. Videre studier og terapeutisk bruk av disse cellene vil stole på protokoller for konsekvent å utlede disse celletyper fra sirkulerende stamceller.

Primære celler som BOEC kan brukes som surrogat for å oppnå svært proliferative modne endotelceller⁶. BOEC er fenotypisk forskjellig fra tidlige EPC-er og viser typiske endoteltrekk som brosteinsmorfologi og uttrykk for adherenskryss og caveolae¹². Genprofilering av Hebbel et ^al.13,14,15 fant at BOEC eller ECFC er de sanne endotelceller da de fremmer mikrovaskulær og dannelse av store fartøy. Dermed kan BOEC brukes som et verktøy for å evaluere patofysiologiske prosesser og genetisk variasjon¹⁶. De regnes også som en utmerket cellekilde for celleterapi for vaskulær regenerering¹⁷. Derfor er en standardisert protokoll for konsekvent å utlede disse svært proliferative cellene avgjørende.

Mens BOECs gir et kraftig verktøy for å studere menneskelig patofysiologisk og genetisk variasjon, kan en mer homogen kilde til BOECs gi mer robuste og pålitelige eksperimentelle og terapeutiske resultater. Overlegen homogenitet kan oppnås ved å bruke xenogene cellekilder avledet fra genetisk like dyr oppdratt under lignende forhold¹⁸. Mens xenogene cellekilder er tilbøyelige til å fremkalle en vertsimmunrespons, utvikles immunmoduleringsstrategier med sikte på å generere immunkompatible dyr og animalske produkter, inkludert celler. Spesielt griser er en rikelig kilde til perifert blod og brukes ofte til å studere medisinsk utstyr og andre terapier på grunn av anatomiske og fysiologiske likheter med mennesker. Derfor foredler denne studien protokollen for isolering og utvidelse av svært proliferative BOEC fra perifert blod fra svin. Protokollen beskrevet nedenfor er en enkel og pålitelig metode for å oppnå et stort antall BOEC fra et relativt lite volum blod. Kulturene kan utvides gjennom flere passasjer for å generere millioner av celler fra en enkelt blodprøve.

Protocol

Alle dyreforsøk ble godkjent av de respektive Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) ved Medical College of Wisconsin og Mayo Clinic. MERK: I denne studien ble Yorkshire/Landrace/Duroc kryssgriser (Sus domesticus), hann og hunn, 40-80 kg, 3-6 måneder gamle, brukt. 1. Innsamling av perifert blod fra svin Forbered materialer.Fortynn heparinoppløsning til 100 E/ml i steril saltvann. Tilsett 3-4 ml …

Representative Results

Morfologi av dyrkede celler ble observert fra starten av kulturen til BOEC-kolonier ble observert (figur 1). En mindre populasjon av adherente celler begynte å feste seg til kulturskålene og vokse, mens ikke-adherente celler ble fjernet med kulturmediumendringer (figur 1B). Kolonier dukket først opp på dag 6 som en samling endotellignende celler som prolifererte radialt utover fra et sentralt punkt (figur 1D). Etter hvert som ku…

Discussion

BOEC er et kraftig verktøy som kan brukes i ulike vitenskapelige og terapeutiske tilnærminger ^7,8,16. BOEC har blitt brukt til å analysere EC-genuttrykk for å belyse nøkkelfaktorene som er ansvarlige for utviklingen av vaskulære sykdommer og kreft 5,19,20,21. BOEC har også blitt brukt i terapeut…

Materials

19 G needle	Covidien	1188818112
50 mL conical tubes	Corning	352098
6 well plate	BD Falcon	353046
60 mL syringes	Covidien	8881560125
Ammonium chloride solution (0.8%)	Stemcell Technologies	07850
Antibiotic/antimycotic solution (100x)	Gibco	15240-062
Centrifuge	Thermo Scientific	75-253-839
EGM-2 culture medium	Lonza Walkersville	CC-3162
Extension tube	Hanna Pharmaceutical Supply Co.	03382C6227
Fetal bovine serum (FBS)	Atlas Biologicals	F-0500-A
Ficoll-Paque 1077	Cytiva	17144003	Density gradient solution
Heparin sodium injection (1,000 units/mL)	Pfizer	00069-0058-01
Human plasma fibronectin	Gibco	33016-015
Ice	N/A	N/A
Phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	10010-023
Pipette set	Eppendorf	2231300004
Sterile water	Gibco	15230-162
Thin pipette	Celltreat Scientific	229280