Karakterisering av blodutväxt endotelceller (BOEC) från svin perifert blod
Abstract
Endotelet är en dynamisk integrerad struktur som spelar en viktig roll i många fysiologiska funktioner såsom angiogenes, hemostas, inflammation och homeostas. Endotelet spelar också en viktig roll i patofysiologier som ateroskleros, hypertoni och diabetes. Endotelceller bildar det inre fodret av blod och lymfkärl och uppvisar heterogenitet i struktur och funktion. Olika grupper har utvärderat funktionaliteten hos endotelceller härledda från humant perifert blod med fokus på endoteliala stamceller härledda från hematopoetiska stamceller eller mogna endotelceller (eller endotelkolonibildande celler). Dessa celler ger en autolog resurs för terapi och sjukdomsmodellering. Xenogena celler kan utgöra en alternativ behandlingskälla på grund av deras tillgänglighet och homogenitet som uppnås genom användning av genetiskt likartade djur som föds upp under liknande förhållanden. Därför har ett robust protokoll för isolering och expansion av mycket proliferativa endotelceller från perifert svin presenterats. Dessa celler kan användas för många tillämpningar såsom kardiovaskulär vävnadsteknik, cellterapi, sjukdomsmodellering, läkemedelsscreening, studier av endotelcellbiologi och in vitro-samkulturer för att undersöka inflammatoriska och koagulationssvar vid xenotransplantation.
Introduction
Endotelet är en mycket komplex, dynamisk struktur och en viktig komponent i kärlväggen. Det leder den inre ytan av blodkärl för att ge ett fysiskt gränssnitt mellan cirkulerande blod och omgivande vävnader. Denna heterogena struktur är känd för att utföra olika funktioner såsom angiogenes, inflammation, vasoregulering och hemostas 1,2,3,4. Humana navelvenendotelceller är en allmänt studerad celltyp för att bedöma funktionaliteten hos endotelceller. Den patientspecifika satsvariabiliteten, inkonsekventa fenotypen och minsta delningseffektiviteten tyder dock på ett behov av att bestämma en cellkälla som kan förbättra alla dessa funktioner5.
Att erhålla en homogen population av primära endotelceller kan vara tekniskt utmanande, och primära endotelceller har inte hög proliferativ kapacitet6. För att studera vaskulär regenerering och utvärdera patofysiologiska processer har olika grupper försökt erhålla och bedöma olika typer av endotelceller härledda från perifert blod, t.ex. endoteliala stamceller (EPC) eller blodutväxande endotelceller (BOEC)6,7,8,9 . De spindelformade tidiga EPC: erna härstammar från hematopoetiska stamceller (HSC) och har begränsad tillväxtstyrka och begränsad angiogen förmåga att producera mogna endotelceller. Dessutom liknar de nära inflammatoriska monocyter. Dessutom är deras förmåga att ytterligare differentiera till funktionella, proliferera, mogna endotelceller fortfarande diskutabel 6,7,9,10. Den kontinuerliga odlingen av mononukleära celler i perifert blod (PBMC) kan ge upphov till en sekundär population av celler som kallas EPC med sen utväxt, BOEC eller endotelkolonibildande celler (ECFC)6,7,9,10. Medina et al. erkände 2018 begränsningarna hos EPC, tvetydigheten i deras nomenklatur, tillsammans med en allmän brist på överensstämmelse med många distinkta celltyper kontinuerligt grupperade under EPC11. Däremot har BOECs blivit erkända för sin roll i vaskulär reparation, hälsa och sjukdom och cellterapi. Ytterligare studier och terapeutisk användning av dessa celler kommer att förlita sig på protokoll för att konsekvent härleda dessa celltyper från cirkulerande stamceller.
Primära celler såsom BOEC kan användas som ett surrogat för att erhålla mycket proliferativa mogna endotelceller6. BOEC skiljer sig fenotypiskt från tidiga EPC och uppvisar typiska endotelegenskaper såsom kullerstensmorfologi och uttryck av vidhäftande korsningar och caveolae12. Genprofilering av Hebbel et al.13,14,15 fann att BOEC eller ECFC är de sanna endotelcellerna eftersom de främjar mikrovaskulär och stor kärlbildning. Således kan BOEC användas som ett verktyg för att utvärdera patofysiologiska processer och genetisk variation16. De anses också vara en utmärkt cellkälla för cellterapi för vaskulär regenerering17. Därför är ett standardiserat protokoll för att konsekvent härleda dessa mycket proliferativa celler viktigt.
Medan BOEC ger ett kraftfullt verktyg för att studera mänsklig patofysiologisk och genetisk variation, kan en mer homogen källa till BOEC ge mer robusta och tillförlitliga experimentella och terapeutiska resultat. Överlägsen homogenitet kan uppnås genom användning av xenogena cellkällor som härrör från genetiskt likartade djur som fötts upp under liknande förhållanden18. Medan xenogena cellkällor är benägna att framkalla ett värdimmunsvar, utvecklas immunmodulerande strategier med målet att generera immunkompatibla djur och animaliska produkter, inklusive celler. I synnerhet grisar är en riklig källa till perifert blod och används ofta för att studera medicintekniska produkter och andra terapier på grund av anatomiska och fysiologiska likheter med människor. Därför förfinar denna studie protokollet för isolering och expansion av mycket proliferativa BOEC från perifert blod från svin. Protokollet som beskrivs nedan är en enkel och pålitlig metod för att erhålla ett stort antal BOEC från en relativt liten volym blod. Kulturerna kan expanderas genom flera passager för att generera miljontals celler från ett enda blodprov.
Protocol
Representative Results
Discussion
BOEC är ett kraftfullt verktyg som kan användas i olika vetenskapliga och terapeutiska metoder 7,8,16. BOEC har använts för att analysera EG-genuttryck för att belysa de viktigaste faktorerna som är ansvariga för utvecklingen av kärlsjukdomar och cancer 5,19,20,21. BOEC har också använts i te…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill uppmärksamma finansiering från NIH / NHLBI R00 HL129068.
Materials
| 19 G needle | Covidien | 1188818112 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 352098 | |
| 6 well plate | BD Falcon | 353046 | |
| 60 mL syringes | Covidien | 8881560125 | |
| Ammonium chloride solution (0.8%) | Stemcell Technologies | 07850 | |
| Antibiotic/antimycotic solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75-253-839 | |
| EGM-2 culture medium | Lonza Walkersville | CC-3162 | |
| Extension tube | Hanna Pharmaceutical Supply Co. | 03382C6227 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Ficoll-Paque 1077 | Cytiva | 17144003 | Density gradient solution |
| Heparin sodium injection (1,000 units/mL) | Pfizer | 00069-0058-01 | |
| Human plasma fibronectin | Gibco | 33016-015 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Pipette set | Eppendorf | 2231300004 | |
| Sterile water | Gibco | 15230-162 | |
| Thin pipette | Celltreat Scientific | 229280 |
References
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds. Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms. Circulation Research. 100 (2), 158-173 (2007).
- Pober, J. S., Tellides, G. Participation of blood vessel cells in human adaptive immune responses. Trends in Immunology. 33 (1), 49-57 (2012).
- Navarro, S., et al. The endothelial cell protein C receptor: its role in thrombosis. Thrombosis Research. 128 (5), 410-416 (2011).
- Hasstedt, S. J., et al. Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis. Blood. 114 (14), 3084-3091 (2009).
- Ormiston, M. L., et al. Generation and culture of blood outgrowth endothelial cells from human peripheral blood. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53384 (2015).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. Journal of Clinical Investigation. 105 (1), 71-77 (2000).
- Martin-Ramirez, J., Hofman, M., Biggelaar, M. V. D., Hebbel, R. P., Voorberg, J. Establishment of outgrowth endothelial cells from peripheral blood. Nature Protocols. 7 (9), 1709-1715 (2012).
- Gulati, R., et al. Diverse origin and function of cells with endothelial phenotype obtained from adult human blood. Circulation Research. 93 (11), 1023-1025 (2003).
- Hebbel, R. P. Blood endothelial cells: utility from ambiguity. The Journal of Clinical Investigation. 127 (5), 1613-1615 (2017).
- Medina, R. J., et al. Endothelial progenitors: A consensus statement on nomenclature. Stem Cells Translational Medicine. 6 (5), 1316-1320 (2018).
- Medina, R. J., et al. Molecular analysis of endothelial progenitor cell (EPC) subtypes reveals two distinct cell populations with different identities. BMC Medical Genomics. 3, 18 (2010).
- Jiang, A., Pan, W., Milbauer, L. C., Shyr, Y., Hebbel, R. P. A practical question based on cross-platform microarray data normalization: are BOEC more like large vessel or microvascular endothelial cells or neither of them. Journal of Bioinformatics and Computational Biology. 5 (4), 875-893 (2007).
- Pan, W., Shen, X., Jiang, A., Hebbel, R. P. Semi-supervised learning via penalized mixture model with application to microarray sample classification. Bioinformatics. 22 (19), 2388-2395 (2006).
- Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (9), 1584-1595 (2008).
- Fernandez, L. A., et al. Blood outgrowth endothelial cells from hereditary haemorrhagic telangiectasia patients reveal abnormalities compatible with vascular lesions. Cardiovascular Research. 68 (2), 235-248 (2005).
- Critser, P. J., Yoder, M. C. Endothelial colony-forming cell role in neoangiogenesis and tissue repair. Current Opinion in Organ Transplantation. 15 (1), 68-72 (2010).
- Zhao, Y., et al. Isolation and culture of primary aortic endothelial cells from miniature pigs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59673 (2019).
- Chang Milbauer, L., et al. Genetic endothelial systems biology of sickle stroke risk. Blood. 111 (7), 3872-3879 (2008).
- Wei, P., et al. Differential endothelial cell gene expression by African Americans versusCaucasian Americans: a possible contribution to health disparity in vascular disease and cancer. BMC Medicine. 9 (1), 2 (2011).
- Hasstedt, S. J., et al. Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 114 (14), 3084-3091 (2009).
- Milbauer, L. C., et al. Blood outgrowth endothelial cell migration and trapping in vivo: a window into gene therapy. Translational Research. 153 (4), 179-189 (2009).
- Matsui, H., et al. Ex vivo gene therapy for hemophilia A that enhances safe delivery and sustained in vivo factor VIII expression from lentivirally engineered endothelial progenitors. Stem Cells. 25 (10), 2660-2669 (2007).
- De Meyer, S. F., et al. Phenotypic correction of von Willebrand disease type 3 blood-derived endothelial cells with lentiviral vectors expressing von Willebrand factor. Blood. 107 (12), 4728-4736 (2006).
- Bodempudi, V., et al. Blood outgrowth endothelial cell-based systemic delivery of antiangiogenic gene therapy for solid tumors. Cancer Gene Therapy. 17 (12), 855-863 (2010).
- Dudek, A. Z., et al. Systemic inhibition of tumour angiogenesis by endothelial cell-based gene therapy. British Journal of Cancer. 97 (4), 513-522 (2007).
- Moubarik, C., et al. Transplanted late outgrowth endothelial progenitor cells as cell therapy product for stroke. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (1), 208-220 (2011).
- Pislaru Sorin, V., et al. Magnetic forces enable rapid endothelialization of synthetic vascular grafts. Circulation. 114 (1), 314 (2006).
- Satyananda, V., et al. New concepts of immune modulation in xenotransplantation. Transplantation. 96 (11), 937-945 (2013).
- Klymiuk, N., Aigner, B., Brem, G., Wolf, E. Genetic modification of pigs as organ donors for xenotransplantation. Molecular Reproduction and Development. 77 (3), 209-221 (2010).
- Ryczek, N., Hryhorowicz, M., Zeyland, J., Lipiński, D., Słomski, R. CRISPR/Cas technology in pig-to-human xenotransplantation research. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 3196 (2021).
- Cooper, D. K., Koren, E., Oriol, R. Genetically engineered pigs. Lancet. 342 (8872), 682-683 (1993).
- Cozzi, E., White, D. J. G. The generation of transgenic pigs as potential organ donors for humans. Nature Medicine. 1 (9), 964-966 (1995).
- Phelps, C. J., et al. Production of alpha 1,3-galactosyltransferase-deficient pigs. Science. 299 (5605), 411-414 (2003).
