גידול לימפוציטים במיקרו-כבידה מדומה באמצעות מערכת תרבית תאים סיבובית
Summary
זהו מדריך שלב אחר שלב לשימוש במערכת תרבית תאים סיבובית זמינה מסחרית לתרבית לימפוציטים במיקרו-כבידה מדומה באמצעות כלי תרבית חד-פעמיים מיוחדים. שיטת גידול זו יכולה להיות מיושמת על כל תרבית תאים מסוג תרחיף.
Abstract
בהתחשב במגבלות הנוכחיות של ביצוע מחקר ביולוגי בחלל, קיימות מספר אפשרויות לחשיפת תרבית תאים למיקרו-כבידה מדומה (SMG) על כדור הארץ. אפשרויות אלה נבדלות זו מזו בשיטותיהן, בעקרונותיהן ובהתאמתן לשימוש בתרבית תאי תרחיף. כאן, מתוארת שיטת תרבית תאים לחשיפת לימפוציטים למיקרו-כבידה מדומה באמצעות מערכת תרבית תאים סיבובית זמינה מסחרית, הידועה גם בשם קלינוסטט דו-ממדי או מכשיר כלי קיר מסתובב (RWV). שיטת תרבית תאים זו משתמשת בעיקרון של ביטול וקטור הכבידה הממוצע בזמן כדי לדמות מיקרו-כבידה על ידי סיבוב התאים על ציר אופקי. התאים המגודלים בתרבית במערכת זו ניתנים לקציר ולשימוש בניסויים רבים ושונים כדי להעריך את ההשפעות של מיקרו-כבידה מדומה על תפקוד התאים והפיזיולוגיה. טכניקת הטיפוח עשויה להשתנות מעט בהתאם לסוג התא או לקו שבו נעשה שימוש, אך השיטה המתוארת כאן עשויה להיות מיושמת על כל תרבית תאים מסוג תרחיף.
Introduction
הוכח כי טיסות לחלל משפיעות על היבטים רבים של הפיזיולוגיה האנושית, כולל מערכת החיסון. מחקרים רבים הוכיחו עדויות לחוסר ויסות חיסוני כתוצאה מטיסה לחלל in vivo וחשיפה למיקרו-כבידה מדומה (SMG) במבחנה 1,2,3,4. היבט מרכזי אחד של סביבת החלל המשפיע על הפיזיולוגיה האנושית הוא מיקרו-כבידה. מיקרו-כבידה מתייחסת ל”חוסר משקל” הנחווה עקב כוחות כבידה נמוכים בסביבת החלל5. ככל שהאנושות מתכוננת למשימות חלל ארוכות יותר לירח ולמאדים, יש צורך במחקר נוסף כדי להפחית סיכונים בריאותיים חמורים לאסטרונאוטים.
תנאי מיקרו-כבידה אמיתיים למחקר מדעי יכולים להיות מושגים בחלל על סיפון תחנת החלל הבינלאומית (ISS) או בננו-לוויינים המשוגרים למסלול; עם זאת, אפשרויות אלה יכולות להיות יקרות ומורכבות להפליא לתזמור. בהתחשב במגבלות הנוכחיות של ביצוע מחקר ביולוגי בחלל, קיימות מספר אפשרויות לגרימת מיקרו-כבידה אמיתית ו-SMG על כדור הארץ. קיימות פעולות בקנה מידה גדול שיכולות לייצר פרקי זמן קצרים של מיקרו-כבידה אמיתית על כדור הארץ, כולל מגדלי נפילה, טיסה פרבולית ורקטות קול. עם זאת, שיטות אלה אינן מתאימות יתר על המידה לחקר ההשפעות של מיקרו-כבידה על מערכות ביולוגיות, בעיקר בשל פרקי הזמן הקצרים של טיפול במיקרו-כבידה (כלומר, שניות עד 20 דקות). שיטות אלה נידונות ביתר פירוט במקומות אחרים 5,6. אפשרויות המתאימות לתרבית תאים ביולוגית כוללות התקנים בקנה מידה קטן כגון קלינוסטט דו-ממדי או התקני כלי קיר מסתובבים (RWV) וקלינוסטטים תלת-ממדיים או מכונות מיקום אקראיות (RPM). התקנים אלה יכולים להיות מוקמים בתוך אינקובטורים של תרביות תאים המתוחזקים בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2, והם מסובבים את תרבית התאים על ציר אופקי (2D) או על שני צירים ניצבים (3D)5. עם זאת, חשוב להדגיש כי שיטות גידול אלה מייצרות SMG בניגוד למיקרו-כבידה אמיתית, המושגת ביותר במרחב להקשרים של מחקר ביולוגי.
מטרת המאמר הנוכחי היא להתוות את השלבים לחשיפת לימפוציטים ל-SMG באמצעות מכשיר RWV זמין מסחרית (Table of Materials), אשר נופל תחת סיווג קלינוסטט דו-ממדי. אמנם קיים פרוטוקול כללי זמין מהיצרן להפעלת מכשיר זה, אך המאמר הנוכחי נועד לכסות את שלבי פתרון הבעיות והאופטימיזציה בפירוט רב יותר. מאמר זה מכסה גם את התיאוריה מאחורי איך המכשיר הזה עובד כדי לייצר SMG בתרבית תאי השעיה, במיוחד עם לימפוציטים. בהקשר זה, תרבית תאי תרחיף מתייחסת לתאים הגדלים בחופשיות בתרבית משלימה, ללא היצמדות לפיגומים נוספים. סוגי תאים רבים גדלים בתרבית תאי תרחיף, כולל לימפוציטים. לימפוציטים הם תאים של מערכת החיסון, כולל תאי T, B והרג טבעי (NK), השוכנים באיברי הלימפה ובזרם הדם7.
קלינוסטט RWV 2D המתואר כאן פועל על עקרון ביטול וקטור הכבידה הממוצע בזמן 5,6,8,9, לפיו וקטור הכבידה מחולק באופן אקראי באמצעות סיבוב של תרבית התא על ציר אופקי. זה מושג על ידי התאמת מהירות הסיבוב של כלי התרבית למהירות השקיעה של התאים. כל עוד מהירות הסיבוב של כלי התרבית מותאמת היטב למהירות השקיעה של התאים, התאים נשמרים בנפילה חופשית ואינם מסוגלים לשקוע, כפי שחווים בסביבת החלל. לאחר שלב ההאצה הראשוני, המדיה בכלי התרבית מגיעה בסופו של דבר ל”סיבוב גוף מוצק” לאורך זמן. סיבוב אופקי זה גורם גם לזרימה למינרית בכלי תרבית התא. זה יוצר סביבה “נמוכה גזירה”, בהתחשב בכך שלחץ הגזירה המושרה על התאים על ידי זרימה למינרית הוא הרבה פחות מזה של זרימה טורבולנטית. עם זאת, בהתחשב בכך שהקלינוסטט אינו מערכת מושלמת, מוצגות כמה תנועות נוזל למינריות קטנות, אשר גורמות ללחץ גזירה מינימלי על התאים. ככאלה, התאים המרחפים במדיה נגררים על ידי זרימה זו במהלך הסיבוב. במהלך סיבוב אופקי, וקטור הכבידה פועל על התאים ומביא אותם למסלול מתנודד, כפי שניתן לראות באיור 1. מקור קטן נוסף של לחץ גזירה נגרם על ידי התאים “נופלים” דרך התקשורת, מה שגורם לזרימה למינרית סביב התאים. כאשר כלי התרבית מסתובב על ציר אופקי, וקטור הכבידה שחווים התאים מסתובב גם כן. עם הזמן, וקטור הכבידה המסתובב הזה מתקרב בממוצע לאפס; תופעה זו נקראת ביטול וקטור כבידה ממוצע זמן וגורמת למצב של SMG 5,6,8,9. מכשיר זה שימש לחקר ההשפעות של SMG על סוגים רבים של תאים, שחלקם מכוסים בהפניות10,11,12. דוגמאות נוספות ניתן למצוא באתר האינטרנט של יצרן המכשיר.
התקן RWV זה משתמש ב”כלי יחס גובה-רוחב גבוה” (HARVs) מיוחדים הזמינים דרך יצרן המכשיר. HARV אלה מחזיקים 10 מ”ל של תרבית תאים כל אחד; עם זאת, 50 מ”ל HARV זמינים גם. ניתן להשתמש ב- HARV של 10 מ”ל או 50 מ”ל בהתאם למספר התאים הדרושים כדי להשלים כל בדיקה ניסיונית במורד הזרם, המתוארת בהמשך פרק הדיון. ה-HARV עשויים מפוליקרבונט וכוללים קרום חמצון סיליקון כדי לאפשר חילופי גזים במהלך תרבית תאים. זה שומר על ה- pH של המדיה התאית ומאפשר נשימה תאית יעילה. יש פתח מילוי ראשי ושתי יציאות מזרק מכוסים על פני הספינה (איור 2A). לאחר טעינת תרבית התאים דרך פתח המילוי הראשי, שני מזרקים נטענים על הכלי כדי לסייע בהסרת הבועות. בעת שימוש בכלי 10 מ”ל, שני מזרקים 3 מ”ל לעבוד טוב. מזרק אחד מחובר למכשיר ריק, כאשר המזרק מדוכא לחלוטין, והשני מחובר מלא ב-3 מ”ל של תרבית תאים (איור 2E). אלה משמשים בשילוב כדי להסיר בועות מן הכלי, אשר חשוב לשמירה על הטיפול SMG. באופן כללי, מומלץ להגדיר שני פקדים שליליים, אשר ניתן לכנות את פקד “Flask” ואת “1G” פקד. בקרת “Flask” מתאימה לתאים הגדלים בצלוחית תרבית תאי תרחיף T25 סטנדרטית. בקרת 1G מתאימה לתאים הגדלים בכלי התרבות המיוחד של 10 מ”ל, אשר פשוט ממוקם באינקובטור (כלומר, מבלי להיות נתון לטיפול SMG). עיין בסעיף דיון לקבלת פרטים נוספים על פקדים.
השיטה המתוארת כאן מתאימה לכל חוקר המעוניין לחקור את ההשפעות של SMG על לימפוציטים, עם התמקדות ספציפית בתאי NK באמצעות קו תאי NK9213. התוצאות ממחקרים אלה עשויות לעזור לנו להבין טוב יותר ולמתן את ההשפעות השליליות של טיסה לחלל על מערכת החיסון האנושית.
Protocol
Representative Results
Discussion
ככל שהאנושות מתכוננת למשימות חלל ארוכות יותר לירח ולמאדים, יש צורך במחקר נוסף כדי להפחית סיכונים בריאותיים חמורים לאסטרונאוטים. היבט מרכזי אחד של סביבת החלל המשפיע על הפיזיולוגיה האנושית הוא מיקרו-כבידה. כאן, תוארה שיטת תרבית תאים לחשיפת לימפוציטים ל- SMG באמצעות מערכת תרבית תאים סיבובית ז…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי סוכנות החלל הקנדית (CSA), מענק מחקר (17ILSRA3, פרופיל חיסוני). המחברים רוצים להכיר ולהודות לד”ר רוקסן פורנייה (אוניברסיטת טורונטו), ד”ר רנדל גרג (אוניברסיטת לינקולן ממוריאל) ופרטש מילבאטולה (אוניברסיטת אריזונה) על עזרתם בפתרון הבעיות הראשוני של פרוטוקול זה.
Materials
| Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL) | Synthecon | D-410 | Gamma sterilized culture vessels (4/box) |
| Luer-Lok tip syringes (3 mL) | BD | 309657 | For attaching to the 10 mL HARVs |
| NK92 Cell-line | ATCC | CRL-2407 | |
| Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4D | Rotating wall vessel device; 2D clinostat |
| Sarsedt 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 50-809-220 | |
| Sarsedt 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 50-809-218 | |
| Sarsedt sterile serological pipettes | Fisher Scientific | 86.1254.001 | |
| T25 suspension culture flasks | Sarsedt | 83.3910.502 | For flask control |
References
- ElGindi, M., et al. May the force be with you (or not): the immune system under microgravity. Cells. 10 (8), 1941 (2021).
- Choukèr, A., Ullrich, O. . The Immune System in Space: Are we Prepared. , (2016).
- Crucian, B. E., et al. Immune system dysregulation during spaceflight: potential countermeasures for deep space exploration missions. Frontiers in Immunology. 9, 1437 (2018).
- Crucian, B. E., et al. Countermeasures-based improvements in stress, immune system dysregulation and latent herpesvirus reactivation onboard the International Space Station – relevance for deep space missions and terrestrial medicine. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 115, 68-76 (2020).
- Herranz, R., et al. Ground-based facilities for simulation of microgravity: organism-specific recommendations for their use, and recommended terminology. Astrobiology. 13 (1), 1-17 (2013).
- Ferranti, F., Del Bianco, M., Pacelli, C. Advantages and limitations of current microgravity platforms for space biology research. Applied Sciences. 11 (1), 68 (2020).
- Murphy, K., Weaver, C. . Janeway’s Immunobiology 9th Edition. , (2016).
- Dedolph, R. R., Dipert, M. H. The physical basis of gravity stimulus nullification by clinostat rotation. Plant Physiology. 47 (6), 756-764 (1971).
- Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281 (1), 12-25 (2001).
- Crabbé, A. Transcriptional and proteomic responses of Pseudomonas aeruginosa PAO1 to spaceflight conditions involve Hfq regulation and reveal a role for oxygen. Applied and Environmental Microbiology. 77 (4), 1221-1230 (2011).
- Ulbrich, C., et al. The impact of simulated and real microgravity on bone cells and mesenchymal stem cells. BioMed Research International. 2014, 1-15 (2014).
- Martinez, E. M., Yoshida, M. C., Candelario, T. L. T., Hughes-Fulford, M. Spaceflight and simulated microgravity cause a significant reduction of key gene expression in early T-cell activation. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (6), 480-488 (2015).
- Jong, J., Maki, G., Klingemann, H. Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells. Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).
- Williams, B. A., et al. A phase I trial of NK-92 cells for refractory hematological malignancies relapsing after autologous hematopoietic cell. Oncotarget. 8 (51), 89256-89268 (2017).
- Cryopreservation of mammalian cell lines video protocol. Abcam Available from: https://www.abcam.com/protocols/cryopreservation-of-mammalian-cell-lines-video-protocol (2022)
- Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2022)
- Mylabathula, P. L., et al. Simulated microgravity disarms human NK-cells and inhibits anti-tumor cytotoxicity in vitro. Acta Astronautica. 174, 32-40 (2020).
- Li, Q., et al. Effects of simulated microgravity on primary human NK cells. Astrobiology. 13 (8), 703-714 (2013).
- Shao, D., et al. Mechanisms of the effect of simulated microgravity on the cytotoxicity of NK cells following the DNA methylation of NKG2D and the expression of DAP10. Microgravity Science and Technology. 33 (1), 6 (2021).
- Castro, S. L., Nelman-Gonzalez, M., Nickerson, C. A., Ott, C. M. Induction of attachment-independent biofilm formation and repression of hfq expression by low-fluid-shear culture of Staphylococcus aureus. Applied and Environmental Microbiology. 77 (18), 6368-6378 (2011).
- Phelan, M. A., Gianforcaro, A. L., Gerstenhaber, J. A., Lelkes, P. I. An air bubble-isolating rotating wall vessel bioreactor for improved spheroid/organoid formation. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (8), 479-488 (2019).
