Coltura di linfociti in microgravità simulata utilizzando un sistema di coltura cellulare rotante
Summary
Questa è una guida passo-passo per l’utilizzo di un sistema di coltura cellulare rotante disponibile in commercio per la coltura di linfociti in microgravità simulata utilizzando vasi di coltura monouso specializzati. Questo metodo di coltura può essere applicato a qualsiasi coltura cellulare di tipo sospensione.
Abstract
Dati gli attuali limiti della conduzione della ricerca biologica nello spazio, esistono alcune opzioni per sottoporre la coltura cellulare alla microgravità simulata (SMG) sulla Terra. Queste opzioni variano nei loro metodi, principi e idoneità per l’uso con colture cellulari in sospensione. Qui, viene descritto un metodo di coltura cellulare per sottoporre i linfociti a microgravità simulata utilizzando un sistema di coltura cellulare rotante disponibile in commercio, noto anche come clinostato 2D o dispositivo di vaso a parete rotante (RWV). Questo metodo di coltura cellulare utilizza il principio della nullificazione del vettore gravitazionale mediato nel tempo per simulare la microgravità ruotando le cellule su un asse orizzontale. Le cellule coltivate in questo sistema possono essere raccolte e utilizzate in molti saggi sperimentali diversi per valutare gli effetti della microgravità simulata sulla funzione cellulare e sulla fisiologia. La tecnica di coltura può variare leggermente a seconda del tipo di cellula o della linea utilizzata, ma il metodo qui descritto può essere applicato a qualsiasi coltura cellulare di tipo sospensione.
Introduction
È stato dimostrato che il volo spaziale ha un impatto su molti aspetti della fisiologia umana, incluso il sistema immunitario. Molti studi hanno dimostrato prove di disregolazione immunitaria a seguito del volo spaziale in vivo e dell’esposizione alla microgravità simulata (SMG) in vitro 1,2,3,4. Un aspetto importante dell’ambiente spaziale che influisce sulla fisiologia umana è la microgravità. La microgravità si riferisce alla “assenza di peso” sperimentata a causa delle basse forze gravitazionali nell’ambiente spaziale5. Mentre l’umanità si prepara per missioni spaziali più lunghe sulla Luna e su Marte, è necessario condurre ulteriori ricerche per mitigare i gravi rischi per la salute degli astronauti.
Condizioni reali di microgravità per la ricerca scientifica possono essere raggiunte nello spazio a bordo della Stazione Spaziale Internazionale (ISS) o in nanosatelliti lanciati in orbita; Tuttavia, queste opzioni possono essere incredibilmente costose e complesse da orchestrare. Dati gli attuali limiti della conduzione della ricerca biologica nello spazio, esistono diverse opzioni per indurre la microgravità reale e SMG sulla Terra. Esistono operazioni su larga scala che possono produrre brevi periodi di microgravità reale sulla Terra, tra cui torri di lancio, volo parabolico e razzi sonda. Tuttavia, questi metodi non sono eccessivamente adatti per studiare gli effetti della microgravità sui sistemi biologici, in gran parte a causa dei loro brevi periodi di trattamento in microgravità (cioè secondi a 20 minuti). Questi metodi sono discussi più dettagliatamente altrove 5,6. Le opzioni adatte per la coltura cellulare biologica includono dispositivi su piccola scala come clinostati 2D o dispositivi di vasi rotanti a parete (RWV) e clinostati 3D o macchine di posizionamento casuale (RPM). Questi dispositivi possono essere installati all’interno di incubatori di colture cellulari mantenuti a 37 °C e al 5% di CO2 e ruotano la coltura cellulare su un asse orizzontale (2D) o su due assi perpendicolari (3D)5. Tuttavia, è importante sottolineare che questi metodi di coltura producono SMG in contrasto con la microgravità reale, che è più fattibile nello spazio per contesti di ricerca biologica.
L’obiettivo del presente documento è quello di delineare i passaggi per sottoporre i linfociti a SMG utilizzando un dispositivo RWV (Table of Materials) disponibile in commercio, che rientra nella classificazione 2D clinostat. Mentre esiste un protocollo generale disponibile dal produttore per il funzionamento di questo dispositivo, l’articolo corrente mira a coprire i passaggi di risoluzione dei problemi e ottimizzazione in modo più dettagliato. Questo articolo copre anche la teoria alla base di come funziona questo dispositivo per produrre SMG in coltura cellulare in sospensione, in particolare con i linfociti. In questo contesto, la coltura cellulare in sospensione si riferisce alle cellule che crescono liberamente in terreni di coltura integrati, senza aderire ad alcuna impalcatura aggiuntiva. Molti tipi di cellule vengono coltivati in coltura cellulare in sospensione, compresi i linfociti. I linfociti sono cellule del sistema immunitario, comprese le cellule T, B e Natural Killer (NK), che risiedono negli organi linfoidi e nel flusso sanguigno7.
Il clinostato RWV 2D qui descritto opera sul principio dell’annullamento del vettore gravitazionale mediato nel tempo 5,6,8,9, per cui il vettore gravitazionale è randomizzato attraverso la rotazione della coltura cellulare su un asse orizzontale. Ciò si ottiene abbinando la velocità di rotazione del recipiente di coltura alla velocità di sedimentazione delle cellule. Finché la velocità di rotazione del recipiente di coltura è ben abbinata alla velocità di sedimentazione delle cellule, le cellule sono mantenute in caduta libera e incapaci di sedimentare, come sperimentato nell’ambiente spaziale. Dopo una fase iniziale di accelerazione, il mezzo nel recipiente di coltura raggiunge la “rotazione del corpo solido” nel tempo. Questa rotazione orizzontale induce anche il flusso laminare nel vaso di coltura cellulare. Questo crea un ambiente “low shear”, dato che lo sforzo di taglio indotto sulle celle dal flusso laminare è molto inferiore a quello del flusso turbolento. Tuttavia, dato che il clinostato non è un sistema perfetto, vengono introdotti alcuni piccoli movimenti del fluido laminare, che infliggono uno stress di taglio minimo alle cellule. Pertanto, le celle sospese nel supporto vengono trascinate da questo flusso durante la rotazione. Durante la rotazione orizzontale, il vettore gravitazionale agisce sulle celle e le porta in una traiettoria oscillante, come visualizzato nella Figura 1. Un’altra piccola fonte di stress da taglio è causata dalle cellule che “cadono” attraverso i media, causando il flusso laminare intorno alle cellule. Mentre il recipiente di coltura ruota su un asse orizzontale, ruota anche il vettore di gravità sperimentato dalle cellule. Nel corso del tempo, questo vettore di gravità rotante si avvicina in media allo zero; questo fenomeno è chiamato nullificazione del vettore gravitazionale mediato nel tempo e induce uno stato di SMG 5,6,8,9. Questo dispositivo è stato utilizzato per studiare gli effetti di SMG su molti tipi di cellule, alcune delle quali sono trattate nei riferimenti10,11,12. Altri esempi sono disponibili sul sito Web del produttore del dispositivo.
Questo dispositivo RWV utilizza “vasi ad alto rapporto d’aspetto” (HARV) specializzati disponibili tramite il produttore del dispositivo. Questi HARV contengono 10 ml di coltura cellulare ciascuno; tuttavia, sono disponibili anche HARV da 50 ml. Possono essere utilizzati HARV da 10 ml o 50 ml a seconda di quante cellule sono necessarie per completare qualsiasi test sperimentale a valle, che è descritto ulteriormente nella sezione di discussione. Gli HARV sono realizzati in policarbonato e includono una membrana di ossigenazione in silicone per consentire lo scambio di gas durante la coltura cellulare. Questo mantiene il pH del mezzo cellulare e consente una respirazione cellulare efficiente. C’è una porta di riempimento principale e due porte per siringhe con tappo sulla faccia del recipiente (Figura 2A). Dopo aver caricato la coltura cellulare attraverso la porta di riempimento principale, due siringhe vengono caricate sul recipiente per facilitare la rimozione delle bolle. Quando si usano i recipienti da 10 ml, due siringhe da 3 ml funzionano bene. Una siringa è attaccata al dispositivo vuota, con la siringa completamente premuta e l’altra è attaccata riempita con 3 ml di coltura cellulare (Figura 2E). Questi sono usati in combinazione per rimuovere le bolle dal vaso, che è importante per mantenere il trattamento SMG. In generale, si consiglia di impostare due controlli negativi, che possono essere indicati come il controllo “Flask” e il controllo “1G”. Il controllo “Flask” corrisponde alle cellule che vengono coltivate in un pallone di coltura cellulare di sospensione T25 standard. Il controllo 1G corrisponde alle cellule che vengono coltivate nel recipiente di coltura specializzato da 10 ml, che viene semplicemente inserito nell’incubatore (cioè senza essere sottoposto al trattamento SMG). Si prega di consultare la sezione Discussione per ulteriori dettagli sui controlli.
Il metodo qui descritto è appropriato per qualsiasi ricercatore che desideri studiare gli effetti di SMG sui linfociti, con un focus specifico sulle cellule NK utilizzando la linea cellulare NK9213. I risultati di questi studi possono aiutarci a comprendere meglio e mitigare gli effetti negativi del volo spaziale sul sistema immunitario umano.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mentre l’umanità si prepara per missioni spaziali più lunghe sulla Luna e su Marte, è necessario condurre ulteriori ricerche per mitigare i gravi rischi per la salute degli astronauti. Un aspetto importante dell’ambiente spaziale che influisce sulla fisiologia umana è la microgravità. Qui, è stato descritto un metodo di coltura cellulare per sottoporre i linfociti a SMG utilizzando un sistema di coltura cellulare rotante disponibile in commercio.
Questo protocollo contiene alcuni passagg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è sostenuto dall’Agenzia spaziale canadese (CSA), borsa di ricerca (17ILSRA3, Immuno Profile). Gli autori desiderano riconoscere e ringraziare la dottoressa Roxanne Fournier (Università di Toronto), il dottor Randal Gregg (Lincoln Memorial University) e Preteesh Mylabathula (Università dell’Arizona) per il loro aiuto nella risoluzione dei problemi iniziali di questo protocollo.
Materials
| Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL) | Synthecon | D-410 | Gamma sterilized culture vessels (4/box) |
| Luer-Lok tip syringes (3 mL) | BD | 309657 | For attaching to the 10 mL HARVs |
| NK92 Cell-line | ATCC | CRL-2407 | |
| Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4D | Rotating wall vessel device; 2D clinostat |
| Sarsedt 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 50-809-220 | |
| Sarsedt 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 50-809-218 | |
| Sarsedt sterile serological pipettes | Fisher Scientific | 86.1254.001 | |
| T25 suspension culture flasks | Sarsedt | 83.3910.502 | For flask control |
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