İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinin 2D Kültür Sisteminde Pankreatik Beta Hücre Öncüllerine Farklılaşması
Summary
Mevcut protokol, düzlemsel tek katmanlı insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC’ler) türetilen pankreas progenitörlerinde PDX1 ve NKX6.1 transkripsiyon faktörlerinin birlikte ekspresyonunu arttırmak için geliştirilmiş bir yöntemi açıklamaktadır. Bu, taze matrisin yenilenmesi, hücre yoğunluğunun manipüle edilmesi ve endodermal hücrelerin ayrışmasıyla elde edilir.
Abstract
İnsan pluripotent kök hücreleri (hPSC’ler), erken pankreas gelişimini incelemek ve diyabete genetik katkıda bulunanları araştırmak için mükemmel bir araçtır. Bununla birlikte, hPSC türevi insülin salgılayan hücreler, hücre tedavisi ve hastalık modellemesi için sınırlı verimlilik ve fonksiyonel özelliklerle üretilebilir. Beta hücrelerinin ve diğer endokrin hücrelerin öncüsü olan hPSC türevli pankreas progenitörleri, iki transkripsiyon faktörü PDX1 ve NKX6.1’i birlikte eksprese ettiklerinde, hem in vitro hem de in vivo olarak işlevsel, insülin salgılayan beta hücrelerinin progenitörlerini belirtir. hPSC kaynaklı pankreas progenitörleri şu anda klinik çalışmaların bir parçası olarak tip 1 diyabet hastalarında hücre tedavisi için kullanılmaktadır. Bununla birlikte, mevcut prosedürler yüksek oranda NKX6.1 ve pankreas progenitörleri üretmemekte, bu da fonksiyonel olmayan endokrin hücrelerin ve az sayıda glikoza duyarlı, insülin salgılayan hücrelerin birlikte üretilmesine yol açmaktadır. Bu nedenle bu çalışma, PDX1 ve NKX6.1’in 2D tek katmanda birlikte ekspresyonunu en üst düzeye çıkaran hPSC türevi pankreas progenitörleri üretmek için gelişmiş bir protokol geliştirdi. Hücre yoğunluğu, taze matriksin mevcudiyeti ve hPSC kaynaklı endodermal hücrelerin ayrışması gibi faktörler, üretilen pankreas progenitörlerinde PDX1 ve NKX6.1 seviyelerini artıran ve alternatif hepatik soya olan bağlılığı en aza indiren modüle edilmiştir. Çalışma, in vitro farklılaşma sırasında hücrenin fiziksel ortamını manipüle etmenin soy spesifikasyonunu ve gen ekspresyonunu etkileyebileceğini vurgulamaktadır. Bu nedenle, mevcut optimize edilmiş protokol, hücre tedavisi ve hastalık modellemesi için PDX1 ve NKX6.1 birlikte eksprese eden progenitörlerin ölçeklenebilir üretimini kolaylaştırır.
Introduction
Diyabet, dünya çapında milyonlarca insanı etkileyen karmaşık bir metabolik bozukluktur. İnsülin takviyesi diyabet için tek tedavi seçeneği olarak kabul edilir. Daha ileri vakalar, tüm kadavra pankreasının veya adacıkların transplantasyonu yoluyla elde edilen beta hücre replasman tedavisi ile tedavi edilir 1,2. Transplantasyon tedavisini, dokunun mevcudiyeti ve kalitesi ile sınırlama, transplantasyon prosedürlerinin invazivliği ve immünsüpresanlara olan sürekli ihtiyaç gibi çeşitli konuları çevrelemektedir. Bu, beta hücre replasman tedavisi için yeni ve alternatif seçeneklerin araştırılması ihtiyacını doğurmaktadır 2,3. İnsan pluripotent kök hücreleri (hPSC’ler) son zamanlarda insan pankreas biyolojisini anlamak için umut verici bir araç ve transplantasyon tedavisi için kapsamlı olmayan ve potansiyel olarak daha kişiselleştirilmiş bir kaynak olarak ortaya çıkmıştır 4,5,6,7. İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC’ler) ve insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC’ler) dahil olmak üzere hPSC’ler, yüksek bir kendini yenileme kapasitesine sahiptir ve insan vücudunun herhangi bir doku tipine yol açar. hESC’ler embriyonun iç hücre kütlesinden türetilir ve hiPSC’ler herhangi bir somatik hücre 4,8’den yeniden programlanır.
Yönlendirilmiş farklılaşma protokolleri, hPSC’leri pankreas gelişim aşamaları boyunca invitro olarak sıralı olarak yönlendiren hPSC’lerden pankreas beta hücreleri üretmek için optimize edilmiştir. Bu protokoller hPSC türevi adacık organoidleri üretir. Oradaki pankreas beta hücrelerinin oranını arttırmada büyük ölçüde iyileşmiş olsalar da, protokollerin etkinliği oldukça değişkendir. NKX6.1 + / INSÜLİN + veya C-PEPTIDE + hücrelerinin ~% 40’ından fazlasına artmaz 5,9,10,11,12,13. Bununla birlikte, üretilen beta hücreleri, transkripsiyonel ve metabolik profilleri ve glikoza tepkileri açısından yetişkin insan beta hücreleri ile tamamen aynı değildir 4,5,14. hPSC türevi beta hücreleri, yetişkin insan adacıkları5’e kıyasla PCSK2, PAX6, UCN3, MAFA, G6PC2 ve KCNK3 gibi anahtar beta hücre belirteçlerinin gen ekspresyonundan yoksundur. Ek olarak, hPSC kaynaklı beta hücreleri, glikoza yanıt olarak kalsiyum sinyalini azaltmıştır. Artan glikoz seviyelerine yanıt olarak uygun miktarda insülin salgılamayan birlikte üretilen polihormonal hücrelerle kontamine olurlar5. Öte yandan, adacık öncüleri olan hPSC türevi pankreas progenitörleri, beta hücrelerine kıyasla in vitro olarak daha verimli bir şekilde üretilebilir ve in vivo olarak nakledildiğinde, işlevsel, insülin salgılayan beta hücrelerine olgunlaşabilir15,16. Klinik çalışmalar şu anda T1D deneklerinde transplantasyon üzerine güvenliklerini ve etkinliklerini göstermeye odaklanmıştır.
Özellikle, aynı pankreas progenitör hücresi içinde PDX1 (Pankreatik ve Duodenal Homeobox 1) ve NKX6.1 (NKX6 Homeobox 1) transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonu, beta hücre soyu5’e bağlılık için çok önemlidir. NKX6.1’i eksprese edemeyen pankreas progenitörleri, polihormonal endokrin hücrelere veya fonksiyonel olmayan beta hücrelerine yol açar17,18. Bu nedenle, pankreas progenitör aşamasında PDX1 ve NKX6.1’in yüksek bir birlikte ekspresyonu, sonuçta çok sayıda fonksiyonel beta hücresi üretmek için gereklidir. Çalışmalar, bir embriyoid cismin veya 3D kültürünün, farklılaşan hücrelerin toplandığı pankreas progenitörlerinde PDX1 ve NKX6.1’i geliştirdiğini, PDX1 + / NKX6.1+ popülasyonunun% 40-80’i arasında değiştiğini göstermiştir. Bununla birlikte, süspansiyon kültürleriyle karşılaştırıldığında, 2B farklılaşma kültürleri daha uygun maliyetli, uygulanabilir ve çoklu hücre hatlarında uygulama için uygundur5. Son zamanlarda, tek katmanlı farklılaşma kültürlerinin PDX1 + / NKX6.1 + ‘nın %90’ından fazlasını verdiğini ve hPSC türevi pankreas progenitörlerinin20,21,22 ile birlikte eksprese edildiğini gösterdik. Bildirilen yöntem, üretilen pankreas progenitörlerine yüksek bir çoğaltma kapasitesi verdi ve hepatik soy21 gibi alternatif kader spesifikasyonlarını önledi. Bu nedenle, burada, bu protokol, hPSC’lerin PDX1 ve NKX6.1’i birlikte eksprese eden pankreas beta hücre öncüllerine farklılaşması için oldukça etkili bir yöntem göstermektedir. Bu yöntem, hPSC kaynaklı endodermi ayrıştırma ve hücre yoğunluğunu manipüle etme tekniğini, ardından genişletilmiş bir FGF ve Retinoid sinyallemesinin yanı sıra PDX1 ve NKX6.1 eş ekspresyonunu teşvik etmek için Kirpi inhibisyonunu kullanır (Şekil 1). Bu yöntem, transplantasyon tedavisi ve hastalık modellemesi için hPSC türevi pankreas beta hücre öncüllerinin ölçeklenebilir bir şekilde üretilmesini kolaylaştırabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışma, PDX1 ve NKX6.1’in yüksek bir eş ekspresyonuna sahip hPSC’lerden pankreas progenitörleri üretmek için geliştirilmiş bir protokolü açıklamaktadır. hPSC türevi endodermin taze matriks üzerinde yarı yoğunlukta ayrışması ve yeniden kaplanması, hPSC türevi pankreas progenitörlerinde daha yüksek PDX1 ve NKX6.1 ile sonuçlandı.
Her aşama için büyüme faktörü kokteyli P1-ND 27’ye oldukça benzer olmasına rağmen, FGF ve retinoid sinyalleme ve BMP ve kirpi inh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Katar Ulusal Araştırma Fonu’ndan (QNRF) bir hibe ile finanse edilmiştir (Hibe No. NPRP10-1221-160041).
Materials
| 15 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| 20X TBS Tween 20 | Thermo Scientific | 28360 | |
| 24-well culture plates, flat bottom with lid | Costar | 3524 | |
| 50 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | |
| 6- well culture plates, multidish | Thermo Scientific | 140685 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 0-7920 | |
| Activin A | R&D | 338-AC | Reconstituted in 4 mM HCl |
| Anti NKX6.1 antibody, mouse monoclonal | DSHB | F55A12-C | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
| Anti-PDX1 antibody, guinea pig polyclonal | Abcam | ab47308 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:1000 for immunostaining |
| B27 minus Vit A | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin, heat shock fraction, fatty acid free | Sigma | A7030 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | Reconstituted in DMSO |
| DMEM, high glucose | ThermoFisher | 41965047 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | A-21206 | ||
| DPBS 1X | ThermoFisher | 14190144 | |
| EGF | ThermoFisher | PHG0313 | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
| FGF10 | R&D | 345-FG | Reconstituted in PBS |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8644 | |
| Hoechst 33258 | Sigma | 23491-45-4 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX73 | |
| KnockOut DMEM/F-12 (1X) | Gibco | 12660-012 | |
| KnockOut SR serum replacement | Gibco | 10828-028 | |
| L-Ascorbic acid (vitamin C) | Sigma | A92902 | Reconstituted in distilled water |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | Aliquot the thawed stock and freeze at -20C. |
| MCDB131 | ThermoFisher | 10372019 | |
| Mouse anti-SOX17 | ORIGENE | CF500096 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 85850 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
| Nalgene filter units, 0.2 µm PES | ThermoFisher | 566-0020 | |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reconstituted in distilled water |
| NOGGIN | R&D | 6057-NG | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
| Portable vacuum aspirator | |||
| Rabbit anti-FOXA2 | Cell signaling technology | 3143 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:500 for immunostaining |
| Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625 | Reconstituted in DMSO |
| Rock inhibitor (Y-27632) | ReproCell | 04-0012-02 | Reconstituted in DMSO |
| Round Bottom Polystyrene FACS Tubes with Caps, STERILE | Stellar Scientific | FSC-9010 | |
| SANT-1 | Sigma Aldrich | S4572 | Reconstituted in DMSO |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| StemFlex | ThermoFisher | A3349401 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
| TALI Cellular Analysis Slide | Invitrogen | T10794 | |
| Tali image-based cytometer automated cell counter | Invitrogen | T10796 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| TrypLE 100 mL | ThermoFisher | 12563011 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
References
- Rickels, M. R., Robertson, R. P. Pancreatic islet transplantation in humans: Recent progress and future directions. Endocrine Reviews. 40 (2), 631-668 (2019).
- Latres, E., Finan, D. A., Greenstein, J. L., Kowalski, A., Kieffer, T. J. Navigating two roads to glucose normalization in diabetes: Automated insulin delivery devices and cell therapy. Cell Metabolism. 29 (3), 545-563 (2019).
- Vaithilingam, V., Tuch, B. E. Islet transplantation and encapsulation: An update on recent developments. Review of Diabetic Studies. 8 (1), 51-67 (2011).
- Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (6), 2459-2483 (2021).
- Memon, B., Abdelalim, E. M. Stem cell therapy for diabetes: Beta cells versus pancreatic progenitors. Cells. 9 (2), 283 (2020).
- Balboa, D., Iworima, D. G., Kieffer, T. J. Human pluripotent stem cells to model islet defects in diabetes. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 12, 642152 (2021).
- Gaertner, B., Carrano, A. C., Sander, M. Human stem cell models: Lessons for pancreatic development and disease. Genes & Development. 33 (21-22), 1475-1490 (2019).
- Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Nair, G. G., et al. Recapitulating endocrine cell clustering in culture promotes maturation of human stem-cell-derived β cells. Nature Cell Biology. 21 (2), 263-274 (2019).
- Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
- Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro β-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
- Hrvatin, S., et al. Differentiated human stem cells resemble fetal, not adult, β cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3038-3043 (2014).
- Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
- Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).
- Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).
- Bruin, J. E., et al. Characterization of polyhormonal insulin-producing cells derived in vitro from human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 12 (1), 194-208 (2014).
- Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
- Memon, B., Abdelalim, E. M. Highly efficient differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1. Methods in Molecular Biology. , (2020).
- Memon, B., Karam, M., Al-Khawaga, S., Abdelalim, E. M. Enhanced differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 15 (2018).
- Aigha, I. I., Memon, B., Elsayed, A. K., Abdelalim, E. M. Differentiation of human pluripotent stem cells into two distinct NKX6.1 populations of pancreatic progenitors. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 83 (2018).
- Ali, G., et al. Keratinocytes derived from patient-specific induced pluripotent stem cells recapitulate the genetic signature of psoriasis disease. Stem Cells and Development. 29 (7), 383-400 (2020).
- Elsayed, A. K., et al. Generation of a human induced pluripotent stem cell line (QBRIi009-A) from a patient with a heterozygous deletion of FOXA2. Stem Cell Research. 42, 101705 (2020).
- Davenport, C., Diekmann, U., Budde, I., Detering, N., Naujok, O. Anterior-posterior patterning of definitive endoderm generated from human embryonic stem cells depends on the differential signaling of retinoic acid, Wnt-, and BMP-signaling. Stem Cells. 34 (11), 2635-2647 (2016).
- Schroeder, I. S., et al. Induction and selection of Sox17-expressing endoderm cells generated from murine embryonic stem cells. Cells Tissues Organs. 195 (6), 507-523 (2012).
- Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
- Elsayed, A. K., Younis, I., Ali, G., Hussain, K., Abdelalim, E. M. Aberrant development of pancreatic beta cells derived from human iPSCs with FOXA2 deficiency. Cell Death & Disease. 12 (1), 103 (2021).
- Mfopou, J. K., Chen, B., Mateizel, I., Sermon, K., Bouwens, L. Noggin, retinoids, and fibroblast growth factor regulate hepatic or pancreatic fate of human embryonic stem cells. Gastroenterology. 138 (7), 1-14 (2010).
- Mfopou, J. K., De Groote, V., Xu, X., Heimberg, H., Bouwens, L. Sonic hedgehog and other soluble factors from differentiating embryoid bodies inhibit pancreas development. Stem Cells. 25 (5), 1156-1165 (2007).
- Gattazzo, F., Urciuolo, A., Bonaldo, P. Extracellular matrix: A dynamic microenvironment for stem cell niche. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (8), 2506-2519 (2014).
- Watt, F. M., Huck, W. T. Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).
- Shih, H. P., Panlasigui, D., Cirulli, V., Sander, M. ECM signaling regulates collective cellular dynamics to control pancreas branching morphogenesis. Cell Reports. 14 (2), 169-179 (2016).
- Raza, A., Ki, C. S., Lin, C. C. The influence of matrix properties on growth and morphogenesis of human pancreatic ductal epithelial cells in 3D. Biomaterials. 34 (21), 5117-5127 (2013).
- Lin, H. Y., et al. Fibronectin and laminin promote differentiation of human mesenchymal stem cells into insulin producing cells through activating Akt and ERK. Journal of Biomedical Science. 17, 56 (2010).
- Boretti, M. I., Gooch, K. J. Effect of extracellular matrix and 3D morphogenesis on islet hormone gene expression by Ngn3-infected mouse pancreatic ductal epithelial cells. Tissue Engineering Part A. 14 (12), 1927-1937 (2008).
- Boretti, M. I., Gooch, K. J. Induced cell clustering enhances islet beta cell formation from human cultures enriched for pancreatic ductal epithelial cells. Tissue Engineering. 12 (4), 939-948 (2006).
- Beattie, G. M., Rubin, J. S., Mally, M. I., Otonkoski, T., Hayek, A. Regulation of proliferation and differentiation of human fetal pancreatic islet cells by extracellular matrix, hepatocyte growth factor, and cell-cell contact. Diabetes. 45 (9), 1223-1228 (1996).
- Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), 82076 (2013).
