Mikrofluidisk acoustophorese til gennemstrømningsseparation af gramnegative bakterier ved hjælp af Aptamer-affinitetsperler
Summary
Dette papir beskriver fremstilling og drift af mikrofluidiske acoustophoretiske chips ved hjælp af den mikrofluidiske acoustophorese-teknik og aptamer-modificerede mikroperler, der kan bruges til hurtig, effektiv isolering af gramnegative bakterier fra et medium.
Abstract
Denne artikel beskriver fremstilling og drift af mikrofluidiske acoustophoretiske chips ved hjælp af en mikrofluidisk acoustophorese-teknik og aptamer-modificerede mikroperler, der kan bruges til hurtig og effektiv isolering af gramnegative bakterier fra et medium. Denne metode forbedrer separationseffektiviteten ved hjælp af en blanding af lange, firkantede mikrokanaler. I dette system injiceres prøven og bufferen i indløbsporten gennem en flowregulator. Til perlecentrering og prøveseparation påføres vekselstrøm på den piezoelektriske transducer via en funktionsgenerator med en effektforstærker for at generere akustisk strålingskraft i mikrokanalen. Der er en todelt kanal ved både indløb og udløb, hvilket muliggør samtidig adskillelse, rensning og koncentration. Enheden har en restitutionshastighed på >98% og renhed på 97,8% op til en 10x dosiskoncentration. Denne undersøgelse har vist en genopretningshastighed og renhed højere end de eksisterende metoder til adskillelse af bakterier, hvilket tyder på, at enheden kan adskille bakterier effektivt.
Introduction
Mikrofluidiske platforme udvikles til at isolere bakterier fra medicinske og miljømæssige prøver ud over metoder baseret på dielektrisk overførsel, magnetophorese, perleekstraktion, filtrering, centrifugalmikrofluidik og inertielle effekter og overfladeakustiske bølger 1,2. Påvisning af patogene bakterier fortsættes ved anvendelse af polymerasekædereaktion (PCR), men det er normalt besværligt, komplekst og tidskrævende 3,4. Mikrofluidiske acoustophoresis-systemer er et alternativ til at løse dette gennem rimelig gennemstrømning og ikke-kontaktcelleisolering 5,6,7. Acoustophoresis er en teknologi, der adskiller eller koncentrerer perler ved hjælp af fænomenet materiel bevægelse gennem en lydbølge. Når lydbølger kommer ind i mikrokanalen, sorteres de efter perlernes størrelse, densitet osv., Og celler kan adskilles i henhold til suspensionsmediets biokemiske og elektriske egenskaber 7,8. Derfor er mange acoustophoretiske undersøgelser blevet aktivt forfulgt 9,10,11, og for nylig er 3D numeriske simuleringer af acoustophoretic motion induceret af grænsedrevet akustisk streaming i stående overflade akustisk bølge mikrofluidik blevet introduceret12.
Undersøgelser på forskellige områder undersøger, hvordan man kan erstatte antistoffer 2,3. Aptamer er et målmateriale med høj selektivitet og specificitet, og mange undersøgelser udføres 2,9,10,13. Aptamere har fordele ved lille størrelse, fremragende biologisk stabilitet, lave omkostninger og høj reproducerbarhed sammenlignet med antistoffer og undersøges i diagnostiske og terapeutiske applikationer 2,3,14.
Her beskriver denne artikel en mikrofluidisk acoustophoresis-teknologiprotokol, der kan bruges til hurtig og effektiv adskillelse af gramnegative (GN) bakterier fra et medium ved hjælp af aptamer-modificerede mikroperler. Dette system genererer en todimensionel (2D) akustisk stående bølge gennem enkelt piezoelektrisk aktivering ved samtidig at stimulere to ortogonale resonanser inden for en lang rektangulær mikrokanal for at justere og fokusere aptamer-fastgjorte mikroperler ved knudepunktet og antiknudepunkterne for separationseffektivitet 2,11,15,16 . Der er en todelt kanal ved både indløb og udløb, hvilket muliggør samtidig adskillelse, rensning og koncentration.
Denne protokol kan være nyttig inden for tidlig diagnose af bakterielle infektionssygdomme samt et hurtigt, selektivt og følsomt svar på patogene bakterielle infektioner gennem vandovervågning i realtid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi udviklede en sonisk levitation mikrofluidisk enhed til opsamling og overførsel af GN-bakterier fra kulturprøver med høj hastighed baseret på en kontinuerlig løbemetode i henhold til deres størrelse og type og aptamermodificerede mikroperler. Den lange, firkantede mikrokanal muliggør et enklere design og større omkostningseffektivitet for 2D-acoustophorese end tidligere rapporteret 20,21,22,23,24,25,26.<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Research Foundation of Korea (NRF) tilskud finansieret af den koreanske regering (Ministeriet for Videnskab og IKT). (Nej. Nrf-2021R1A2C1011380)
Materials
| 1 µm polystyrene microbeads | Bang Laboratories | PS04001 | Cell size beads |
| 10 µm Streptavidin-coated microbeads | Bang Laboratories | CP01007 | Aptamer affinity beads |
| 4-inch Silicon Wafer/SU-8 mold | 4science | 29-03573-01 | Components of chip |
| Aptamer | Integrated DNA Technologies | GN3-6' | RNA for bacteria conjugation |
| Borosilicate glass | Schott | BOROFLOAT 33 | Components of chip |
| Centrifuge | Daihan | CF-10 | Wasing particles |
| Cyanoacrylate glue | 3M | AD100 | Attach PZT to microchip |
| Escherichia coli DH5α | KCTC | KCTC2571 | Target bacteria |
| Functional generator | GW Instek | AFG-2225 | Generate frequency |
| High-speed camera | Photron | FASTCAM Mini | Observation of separation |
| Hot plate | As one | HI-1000 | Heating plate for curing of liquid PDMS |
| KOVAX-SYRINGE 10 mL Syringe | Koreavaccine | 22G-10ML | Fill the microfluidic acoustophoresis channel with bubble-free demineralized water. |
| Liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| LB Broth Miller | BD Difco | 244620 | Cell culture (Luria-Bertani medium) |
| Microscope | Olympus Corp. | IX-81 | Observation of separation |
| PBS buffer | Capricorn scientific | PBS-1A | Wasing bacteria |
| PEEK Tubes | Saint-Gobain Ppl Corp. | AAD04103 | Inject or collect particles |
| Piezoelectric transducer | Fuji Ceramics | C-213 | Generate specific wave in channel |
| Power amplifier | Amplifier Research | 75A250A | Amplify frequency |
| Pressure controller/μflucon | AMED | AMED-μflucon | Control of air pressure/flow controller |
| Tris-HCl buffer | invitrogen | 15567027 | Wasing particles |
| Tube rotator | SeouLin Bioscience | SLRM-3 | Modifiying aptamer and bead |
References
- Wu, M., et al. Acoustofluidic separation of cells and particles. Microsystem & Nanoengineering. 5 (1), 1-18 (2019).
- Lee, S. W., et al. Aptamer affinity-bead mediated capture and displacement of Gram-negative bacteria using acoustophoresis. Micromachines. 10 (11), 770 (2019).
- Hirvonen, J. J., et al. One-step sample preparation of positive blood cultures for the direct detection of methicillin-sensitive and -resistant Staphylococcus aureus and methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci within one hour using the automated GenomEra CDXTM PCR system. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (10), 2835-2842 (2012).
- Swaminathan, B., Feng, P. Rapid detection of food-borne pathogenic bacteria. Annual Review of Microbiology. 48 (1), 401-426 (1994).
- Ding, X., et al. On-chip manipulation of single microparticles, cells, and organisms using surface acoustic waves. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (28), 11105-11109 (2012).
- Karthick, S., et al. Acoustic impedance-based size independent isolation of circulating tumor cells from blood using acoustophoresis. Lab on a Chip. 18 (24), 2802 (2018).
- Lenshof, A., et al. Acoustofluidics 8: Applications of acoustophoresis in continuous flow microsystems. Lab on a Chip. 12 (7), 1210-1223 (2012).
- Persson, J., et al. Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection. The FEBS journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).
- Klussmann, S. . The aptamer handbook: Functional oligonucleotides and their applications. , (2006).
- Ellington, A., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Namnabat, M. S., et al. 3D numerical simulation of acoustophoretic motion induced by boundary-driven acoustic streaming in standing surface acoustic wave microfluidics. Scientific Reports. 11 (1), 11326 (2021).
- Nimjee, S. M., et al. Aptamer as therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 61-79 (2017).
- Zhang, Y., et al. Recent advances in aptamer discovery and application. Molecules. 24 (5), 941 (2019).
- Park, J. W., et al. Acousto-microfluidics for screening of ssDNA aptamer. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
- Persson, J., et al. Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection. The FEBS Journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).
- Van Toan, N., et al. An investigation of processes for glass micromachining. Micromachines. 7 (3), 51 (2016).
- Jansen, H., et al. A survey on the reactive ion etching of silicon in microtechnology. Journal of Micromechanics and Microengineering. 6 (1), 14 (1996).
- Hanneborg, A., et al. Silicon-to-silicon anodic bonding with a borosilicate glass layer. Journal of Micromechanics and Microengineering. 1 (3), 139 (1991).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnology and bioengineering. 107 (2), 302-311 (2010).
- Wang, S., et al. Simple filter microchip for rapid separation of plasma and viruses from whole blood. International Journal of Nanomedicine. 7, 5019-5028 (2012).
- Ai, Y., et al. Separation of Escherichia coli bacteria from peripheral blood mononuclear cells using standing surface acoustic waves. Analytical Chemistry. 85 (19), 9126-9134 (2013).
- Ohlsson, P., et al. Acoustic impedance matched buffers enable separation of bacteria from blood cells at high cell concentrations. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Park, S., et al. Continuous dielectrophoretic bacterial separation and concentration from physiological media of high conductivity. Lab on a Chip. 11 (17), 2893-2900 (2011).
- Kim, U., Soh, H. T. Simultaneous sorting of multiple bacterial targets using integrated Dielectrophoretic-Magnetic Activated Cell Sorter. Lab on a Chip. 9 (16), 2313-2318 (2009).
- Cai, G., et al. A fluidic device for immunomagnetic separation of foodborne bacteria using self-assembled magnetic nanoparticle chains. Micromachines. 9 (12), 624 (2018).
