Acoustopforese microfluidica para flowthrough separação de bactérias gram-negativas usando Contas de Afinidade De Aptamer
Summary
Este artigo descreve a fabricação e o funcionamento de chips acoustopforéticos microfluidos usando a técnica de austopforese microfluidica e microesferas modificadas por aptamer que podem ser usadas para o isolamento rápido e eficiente de bactérias Gram-negativas a partir de um meio.
Abstract
Este artigo descreve a fabricação e o funcionamento de chips acoustopforéticos microfluidos usando uma técnica de austopforese microfluídica e microesferas modificadas por aptamer que podem ser usadas para o isolamento rápido e eficiente de bactérias Gram-negativas de um meio. Este método aumenta a eficiência de separação usando uma mistura de microcanais longos e quadrados. Neste sistema, a amostra e o buffer são injetados na porta de entrada através de um controlador de fluxo. Para centralizar as contas e separar amostras, a energia CA é aplicada no transdutor piezoelétrico através de um gerador de função com um amplificador de energia para gerar força de radiação acústica no microcanal. Há um canal bifurcado tanto na entrada quanto na saída, permitindo separação simultânea, purificação e concentração. O dispositivo tem uma taxa de recuperação de >98% e pureza de 97,8% até uma concentração de 10x de dose. Este estudo demonstrou uma taxa de recuperação e pureza superior aos métodos existentes para separar bactérias, sugerindo que o dispositivo pode separar as bactérias de forma eficiente.
Introduction
Plataformas microfluídicas estão sendo desenvolvidas para isolar bactérias de amostras médicas e ambientais, além de métodos baseados na transferência dielétrica, magnetoforese, extração de contas, filtragem, microfluidos centrífugas e efeitos inerciais, e ondas acústicas superficiais 1,2. A detecção de bactérias patogênicas continua usando reação em cadeia de polimerase (PCR), mas geralmente é trabalhosa, complexa e demorada 3,4. Os sistemas de austopforese microfluidica são uma alternativa para lidar com isso através de rendimento razoável e isolamento celular sem contato 5,6,7. Acoustophoresis é uma tecnologia que separa ou concentra contas usando o fenômeno do movimento material através de uma onda sonora. Quando as ondas sonoras entram no microcanal, elas são classificadas de acordo com o tamanho, densidade, etc., das contas, e as células podem ser separadas de acordo com as propriedades bioquímicas e elétricas do meio de suspensão 7,8. Assim, muitos estudos aoustopforéticos foram ativamente perseguidos 9,10,11, e recentemente, simulações numéricas 3D de movimento acoustopforético induzido pelo streaming acústico orientado por limites em microfluidos de onda acústica de superfície em pé foram introduzidas12.
Estudos em diversas áreas estão examinando como substituir anticorpos 2,3. Aptamer é um material-alvo com alta seletividade e especificidade, e muitos estudos estão sendo realizados 2,9,10,13. Os aptamers têm vantagens de pequeno porte, excelente estabilidade biológica, baixo custo e alta reprodutibilidade em relação aos anticorpos e estão sendo estudados em aplicações diagnósticas e terapêuticas 2,3,14.
Aqui, este artigo descreve um protocolo de tecnologia de acoustopforese microfluídica que pode ser usado para a rápida e eficiente separação de bactérias Gram-negativas (GN) de um meio usando microesferas modificadas por aptamer. Este sistema gera uma onda de pé acústica bidimensional (2D) através da atuação piezoelétrica única, estimulando simultaneamente duas ressonâncias ortogonais dentro de um microcanal retangular longo para alinhar e focar microesferas ligadas a aptamer nos pontos de nó e anti-nó para eficiência de separação 2,11,15,16 . Há um canal bifurcado tanto na entrada quanto na saída, permitindo separação simultânea, purificação e concentração.
Este protocolo pode ser útil no campo do diagnóstico precoce de doenças infecciosas bacterianas, bem como uma resposta rápida, seletiva e sensível a infecções bacterianas patogênicas através do monitoramento da água em tempo real.
Protocol
Representative Results
Discussion
Desenvolvemos um dispositivo microfluido de levitação sônica para capturar e transferir bactérias GN de amostras de cultura em alta velocidade com base em um método de execução contínuo de acordo com seu tamanho e tipo, e microesferas modificadas por aptamer. O microcanal longo e quadrado permite um design mais simples e maior custo-benefício para a 2D acoustophoresis do que o relatado anteriormente 20,21,22,23,24,25,26.</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) financiada pelo governo coreano (Ministério da Ciência e TIC). (Não. NRF-2021R1A2C1011380)
Materials
| 1 µm polystyrene microbeads | Bang Laboratories | PS04001 | Cell size beads |
| 10 µm Streptavidin-coated microbeads | Bang Laboratories | CP01007 | Aptamer affinity beads |
| 4-inch Silicon Wafer/SU-8 mold | 4science | 29-03573-01 | Components of chip |
| Aptamer | Integrated DNA Technologies | GN3-6' | RNA for bacteria conjugation |
| Borosilicate glass | Schott | BOROFLOAT 33 | Components of chip |
| Centrifuge | Daihan | CF-10 | Wasing particles |
| Cyanoacrylate glue | 3M | AD100 | Attach PZT to microchip |
| Escherichia coli DH5α | KCTC | KCTC2571 | Target bacteria |
| Functional generator | GW Instek | AFG-2225 | Generate frequency |
| High-speed camera | Photron | FASTCAM Mini | Observation of separation |
| Hot plate | As one | HI-1000 | Heating plate for curing of liquid PDMS |
| KOVAX-SYRINGE 10 mL Syringe | Koreavaccine | 22G-10ML | Fill the microfluidic acoustophoresis channel with bubble-free demineralized water. |
| Liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| LB Broth Miller | BD Difco | 244620 | Cell culture (Luria-Bertani medium) |
| Microscope | Olympus Corp. | IX-81 | Observation of separation |
| PBS buffer | Capricorn scientific | PBS-1A | Wasing bacteria |
| PEEK Tubes | Saint-Gobain Ppl Corp. | AAD04103 | Inject or collect particles |
| Piezoelectric transducer | Fuji Ceramics | C-213 | Generate specific wave in channel |
| Power amplifier | Amplifier Research | 75A250A | Amplify frequency |
| Pressure controller/μflucon | AMED | AMED-μflucon | Control of air pressure/flow controller |
| Tris-HCl buffer | invitrogen | 15567027 | Wasing particles |
| Tube rotator | SeouLin Bioscience | SLRM-3 | Modifiying aptamer and bead |
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