אקוסטופורזיס מיקרופלואידי להפרדת זרימה של חיידקים גראם-שליליים באמצעות חרוזי זיקה של אפטמר
Summary
מאמר זה מתאר את הייצור וההפעלה של שבבי אקוסטופורטי מיקרופלואידיים באמצעות טכניקת האקוסטופורזיס המיקרופלואידית ומיקרובים שעברו שינוי אפטאמר שיכולים לשמש לבידוד מהיר ויעיל של חיידקים גראם-שליליים ממדיום.
Abstract
מאמר זה מתאר את הייצור וההפעלה של שבבי אקוסטופורטי מיקרופלואידיים באמצעות טכניקת אקוסטופורזיס מיקרופלואידית ומיקרובים שעברו שינוי אפטמר שיכולים לשמש לבידוד מהיר ויעיל של חיידקים גראם-שליליים ממדיום. שיטה זו משפרת את יעילות ההפרדה באמצעות שילוב של מיקרו-ערוצים ארוכים ומרובעים. במערכת זו, המדגם והמאגר מוזרקים ליציאת הכניסה באמצעות בקר זרימה. עבור מרכוז חרוזים והפרדת דגימות, כוח AC מוחל על המתמר הפיאזואלקטרי באמצעות מחולל פונקציות עם מגבר כוח כדי ליצור כוח קרינה אקוסטית במיקרו-ערוץ. בכניסה ובשקע יש תעלה דו-פרצופית, המאפשרת הפרדה, טיהור וריכוז בו זמנית. למכשיר שיעור התאוששות של >98% וטוהר של 97.8% עד לריכוז מנה של פי 10. מחקר זה הדגים קצב התאוששות וטוהר גבוהים יותר מהשיטות הקיימות להפרדת חיידקים, מה שמרמז על כך שהמכשיר יכול להפריד חיידקים ביעילות.
Introduction
פלטפורמות מיקרופלואידיות מפותחות כדי לבודד חיידקים מדגימות רפואיות וסביבתיות, בנוסף לשיטות המבוססות על העברה דיאלקטרית, מגנטופורזיס, מיצוי חרוזים, סינון, מיקרופלואידיקה צנטריפוגלית ואפקטים אינרציאליים, וגלים אקוסטיים על פני השטח 1,2. הזיהוי של חיידקים פתוגניים נמשך באמצעות תגובת שרשרת פולימראז (PCR), אך בדרך כלל הואמייגע, מורכב וגוזל זמן רב 3,4. מערכות אקוסטופורזיס מיקרופלואידיות הן חלופה לטיפול בכך באמצעות תפוקה סבירה ובידוד תאים ללא מגע 5,6,7. Acoustophoresis היא טכנולוגיה המפרידה או מרכזת חרוזים באמצעות תופעה של תנועת חומר דרך גל קול. כאשר גלי קול נכנסים למיקרו-ערוץ, הם ממוינים לפי הגודל, הצפיפות וכו’ של החרוזים, וניתן להפריד את התאים לפי התכונות הביוכימיות והחשמליות של מדיום התלייה 7,8. בהתאם לכך, מחקרים אקוסטופורטיים רבים נערכו באופן פעיל 9,10,11, ולאחרונה, סימולציות נומריות תלת-ממדיות של תנועה אקוסטופורטית המושרה על ידי זרימה אקוסטית מונחית גבולות במיקרופלואידיקה של גלים אקוסטיים במשטח עמידה, הוצגו 12.
מחקרים בתחומים שונים בוחנים כיצד להחליף נוגדנים 2,3. אפטמר הוא חומר מטרה בעל סלקטיביות וספציפיות גבוהות, ומחקרים רבים נערכים 2,9,10,13. לאפטמרים יש יתרונות של גודל קטן, יציבות ביולוגית מצוינת, עלות נמוכה ויכולת שכפול גבוהה בהשוואה לנוגדנים והם נחקרים ביישומים אבחוניים וטיפוליים 2,3,14.
במאמר זה מתואר פרוטוקול בטכנולוגיית אקוסטופורזיס מיקרופלואידית שניתן להשתמש בו להפרדה מהירה ויעילה של חיידקים גראם-שליליים (GN) ממדיום באמצעות מיקרובים שעברו שינוי אפטמר. מערכת זו מייצרת גל עמידה אקוסטי דו-ממדי (2D) באמצעות הפעלה פיאזואלקטרית יחידה על ידי גירוי בו-זמני של שתי תהודות אורתוגונליות בתוך מיקרו-ערוץ מלבני ארוך כדי ליישר ולמקד מיקרובים המחוברים לאפטמר בנקודות הצומת והאנטי-צומת ליעילות הפרדה 2,11,15,16 . בכניסה ובשקע יש תעלה דו-פרצופית, המאפשרת הפרדה, טיהור וריכוז בו זמנית.
פרוטוקול זה יכול להיות מועיל בתחום של אבחון מוקדם של מחלות זיהומיות חיידקיות, כמו גם תגובה מהירה, סלקטיבית ורגישה לזיהומים חיידקיים פתוגניים באמצעות ניטור מים בזמן אמת.
Protocol
Representative Results
Discussion
פיתחנו מכשיר מיקרופלואידי לריחוף קולי ללכידה והעברה של חיידקי GN מדגימות תרבית במהירות גבוהה על בסיס שיטת ריצה רציפה בהתאם לגודלם ולסוגם, ומיקרובים שעברו שינוי אפטמר. המיקרו-ערוץ הארוך והמרובע מאפשר תכנון פשוט יותר ויעילות גבוהה יותר עבור אקוסטופורזיס דו-ממדי ממה שדווח בעבר …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) במימון ממשלת קוריאה (משרד המדע והתקשוב). (לא. NRF-2021R1A2C1011380)
Materials
| 1 µm polystyrene microbeads | Bang Laboratories | PS04001 | Cell size beads |
| 10 µm Streptavidin-coated microbeads | Bang Laboratories | CP01007 | Aptamer affinity beads |
| 4-inch Silicon Wafer/SU-8 mold | 4science | 29-03573-01 | Components of chip |
| Aptamer | Integrated DNA Technologies | GN3-6' | RNA for bacteria conjugation |
| Borosilicate glass | Schott | BOROFLOAT 33 | Components of chip |
| Centrifuge | Daihan | CF-10 | Wasing particles |
| Cyanoacrylate glue | 3M | AD100 | Attach PZT to microchip |
| Escherichia coli DH5α | KCTC | KCTC2571 | Target bacteria |
| Functional generator | GW Instek | AFG-2225 | Generate frequency |
| High-speed camera | Photron | FASTCAM Mini | Observation of separation |
| Hot plate | As one | HI-1000 | Heating plate for curing of liquid PDMS |
| KOVAX-SYRINGE 10 mL Syringe | Koreavaccine | 22G-10ML | Fill the microfluidic acoustophoresis channel with bubble-free demineralized water. |
| Liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| LB Broth Miller | BD Difco | 244620 | Cell culture (Luria-Bertani medium) |
| Microscope | Olympus Corp. | IX-81 | Observation of separation |
| PBS buffer | Capricorn scientific | PBS-1A | Wasing bacteria |
| PEEK Tubes | Saint-Gobain Ppl Corp. | AAD04103 | Inject or collect particles |
| Piezoelectric transducer | Fuji Ceramics | C-213 | Generate specific wave in channel |
| Power amplifier | Amplifier Research | 75A250A | Amplify frequency |
| Pressure controller/μflucon | AMED | AMED-μflucon | Control of air pressure/flow controller |
| Tris-HCl buffer | invitrogen | 15567027 | Wasing particles |
| Tube rotator | SeouLin Bioscience | SLRM-3 | Modifiying aptamer and bead |
References
- Wu, M., et al. Acoustofluidic separation of cells and particles. Microsystem & Nanoengineering. 5 (1), 1-18 (2019).
- Lee, S. W., et al. Aptamer affinity-bead mediated capture and displacement of Gram-negative bacteria using acoustophoresis. Micromachines. 10 (11), 770 (2019).
- Hirvonen, J. J., et al. One-step sample preparation of positive blood cultures for the direct detection of methicillin-sensitive and -resistant Staphylococcus aureus and methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci within one hour using the automated GenomEra CDXTM PCR system. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (10), 2835-2842 (2012).
- Swaminathan, B., Feng, P. Rapid detection of food-borne pathogenic bacteria. Annual Review of Microbiology. 48 (1), 401-426 (1994).
- Ding, X., et al. On-chip manipulation of single microparticles, cells, and organisms using surface acoustic waves. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (28), 11105-11109 (2012).
- Karthick, S., et al. Acoustic impedance-based size independent isolation of circulating tumor cells from blood using acoustophoresis. Lab on a Chip. 18 (24), 2802 (2018).
- Lenshof, A., et al. Acoustofluidics 8: Applications of acoustophoresis in continuous flow microsystems. Lab on a Chip. 12 (7), 1210-1223 (2012).
- Persson, J., et al. Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection. The FEBS journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).
- Klussmann, S. . The aptamer handbook: Functional oligonucleotides and their applications. , (2006).
- Ellington, A., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Namnabat, M. S., et al. 3D numerical simulation of acoustophoretic motion induced by boundary-driven acoustic streaming in standing surface acoustic wave microfluidics. Scientific Reports. 11 (1), 11326 (2021).
- Nimjee, S. M., et al. Aptamer as therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 61-79 (2017).
- Zhang, Y., et al. Recent advances in aptamer discovery and application. Molecules. 24 (5), 941 (2019).
- Park, J. W., et al. Acousto-microfluidics for screening of ssDNA aptamer. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
- Persson, J., et al. Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection. The FEBS Journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).
- Van Toan, N., et al. An investigation of processes for glass micromachining. Micromachines. 7 (3), 51 (2016).
- Jansen, H., et al. A survey on the reactive ion etching of silicon in microtechnology. Journal of Micromechanics and Microengineering. 6 (1), 14 (1996).
- Hanneborg, A., et al. Silicon-to-silicon anodic bonding with a borosilicate glass layer. Journal of Micromechanics and Microengineering. 1 (3), 139 (1991).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnology and bioengineering. 107 (2), 302-311 (2010).
- Wang, S., et al. Simple filter microchip for rapid separation of plasma and viruses from whole blood. International Journal of Nanomedicine. 7, 5019-5028 (2012).
- Ai, Y., et al. Separation of Escherichia coli bacteria from peripheral blood mononuclear cells using standing surface acoustic waves. Analytical Chemistry. 85 (19), 9126-9134 (2013).
- Ohlsson, P., et al. Acoustic impedance matched buffers enable separation of bacteria from blood cells at high cell concentrations. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Park, S., et al. Continuous dielectrophoretic bacterial separation and concentration from physiological media of high conductivity. Lab on a Chip. 11 (17), 2893-2900 (2011).
- Kim, U., Soh, H. T. Simultaneous sorting of multiple bacterial targets using integrated Dielectrophoretic-Magnetic Activated Cell Sorter. Lab on a Chip. 9 (16), 2313-2318 (2009).
- Cai, G., et al. A fluidic device for immunomagnetic separation of foodborne bacteria using self-assembled magnetic nanoparticle chains. Micromachines. 9 (12), 624 (2018).
