एप्टामर आत्मीयता मोतियों का उपयोग करके ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के पृथक्करण के माध्यम से प्रवाह के लिए माइक्रोफ्लुइडिक एकोस्टोफोरेसिस
Summary
यह पत्र माइक्रोफ्लुइडिक ध्वनिकोफोरेसिस तकनीक और एप्टामर-संशोधित माइक्रोबीड्स का उपयोग करके माइक्रोफ्लुइडिक ध्वनिकोरेटिक चिप्स के निर्माण और संचालन का वर्णन करता है जिसका उपयोग माध्यम से ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के तेज, कुशल अलगाव के लिए किया जा सकता है।
Abstract
यह लेख माइक्रोफ्लुइडिक ध्वनिकोफोरेसिस तकनीक और एप्टामर-संशोधित माइक्रोबीड्स का उपयोग करके माइक्रोफ्लुइडिक ध्वनिकोरेटिक चिप्स के निर्माण और संचालन का वर्णन करता है जिसका उपयोग माध्यम से ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के तेज, कुशल अलगाव के लिए किया जा सकता है। यह विधि लंबे, चौकोर माइक्रोचैनलों के मिश्रण का उपयोग करके पृथक्करण दक्षता को बढ़ाती है। इस प्रणाली में, नमूना और बफर को प्रवाह नियंत्रक के माध्यम से इनलेट पोर्ट में इंजेक्ट किया जाता है। मनका केंद्रित और नमूना पृथक्करण के लिए, एसी पावर माइक्रोचैनल में ध्वनिक विकिरण बल उत्पन्न करने के लिए पावर एम्पलीफायर के साथ एक फ़ंक्शन जनरेटर के माध्यम से पीजोइलेक्ट्रिक ट्रांसड्यूसर पर लागू होता है। इनलेट और आउटलेट दोनों पर एक विभाजित चैनल है, जो एक साथ पृथक्करण, शुद्धिकरण और एकाग्रता को सक्षम करता है। डिवाइस में >98% की रिकवरी दर और 10x खुराक एकाग्रता तक 97.8% की शुद्धता है। इस अध्ययन ने बैक्टीरिया को अलग करने के लिए मौजूदा तरीकों की तुलना में अधिक वसूली दर और शुद्धता का प्रदर्शन किया है, यह सुझाव देते हुए कि डिवाइस बैक्टीरिया को कुशलतापूर्वक अलग कर सकता है।
Introduction
ढांकता हुआ हस्तांतरण, मैग्नेटोफोरेसिस, मनका निष्कर्षण, फ़िल्टरिंग, केन्द्रापसारक माइक्रोफ्लुइडिक्स और जड़त्वीय प्रभाव, और सतह ध्वनिक तरंगों 1,2 पर आधारित तरीकों के अलावा, चिकित्सा और पर्यावरणीय नमूनों से बैक्टीरिया को अलग करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिकप्लेटफार्मों को विकसित किया जा रहा है। रोगजनक बैक्टीरिया का पता लगाना पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) का उपयोग करके जारी रखा जाता है, लेकिन यह आमतौर पर श्रमसाध्य, जटिल और समय लेने वाला 3,4 होता है। माइक्रोफ्लुइडिक ध्वनिकोफोरेसिस सिस्टम उचित थ्रूपुट और गैर-संपर्क सेल अलगाव 5,6,7 के माध्यम से इसे संबोधित करने का एक विकल्प है। ध्वनिकोफोरेसिस एक ऐसी तकनीक है जो ध्वनि तरंग के माध्यम से सामग्री आंदोलन की घटना का उपयोग करके मोतियों को अलग या केंद्रित करती है। जब ध्वनि तरंगें माइक्रोचैनल में प्रवेश करती हैं, तो उन्हें मोतियों के आकार, घनत्व आदि के अनुसार क्रमबद्ध किया जाता है, और कोशिकाओं को निलंबन माध्यम 7,8 के जैव रासायनिक और विद्युत गुणों के अनुसार अलग किया जा सकता है। तदनुसार, कई ध्वनिक अध्ययनों को सक्रिय रूप से 9,10,11 का पीछा किया गया है, और हाल ही में, खड़े सतह ध्वनिक तरंग माइक्रोफ्लुइडिक्स में सीमा-चालित ध्वनिक स्ट्रीमिंग द्वारा प्रेरित ध्वनिक गति के 3 डी संख्यात्मक सिमुलेशन पेश किए गए हैं।
विभिन्न क्षेत्रों में अध्ययन एंटीबॉडी 2,3 को बदलने के तरीके की जांच कर रहे हैं। एप्टामर एक लक्ष्य सामग्री है जिसमें उच्च चयनात्मकता और विशिष्टता है, और कई अध्ययन 2,9,10,13 आयोजित किए जा रहे हैं। एप्टामर्स में एंटीबॉडी की तुलना में छोटे आकार, उत्कृष्ट जैविक स्थिरता, कम लागत और उच्च प्रजनन क्षमता के फायदे हैं और नैदानिक और चिकित्सीय अनुप्रयोगों 2,3,14 में अध्ययन किया जा रहा है।
यहां, यह लेख एक माइक्रोफ्लुइडिक ध्वनिकोफोरेसिस प्रौद्योगिकी प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जिसका उपयोग एप्टामर-संशोधित माइक्रोबीड्स का उपयोग करके माध्यम से ग्राम-नकारात्मक (जीएन) बैक्टीरिया के तेजी से, कुशल पृथक्करण के लिए किया जा सकता है। यह प्रणाली एकल पीजोइलेक्ट्रिक एक्ट्यूएशन के माध्यम से एक द्वि-आयामी (2 डी) ध्वनिक स्थायी तरंग उत्पन्न करती है, साथ ही एक लंबे आयताकार माइक्रोचैनल के भीतर दो ऑर्थोगोनल अनुनादों को उत्तेजित करके नोड पर एप्टामर-संलग्न माइक्रोबीड्स को संरेखित और फोकस करने के लिए और पृथक्करण दक्षता 2,11,15,16 के लिए एंटी-नोड बिंदुओं को उत्तेजित करती है . इनलेट और आउटलेट दोनों पर एक विभाजित चैनल है, जो एक साथ पृथक्करण, शुद्धिकरण और एकाग्रता को सक्षम करता है।
यह प्रोटोकॉल बैक्टीरिया संक्रामक रोगों के प्रारंभिक निदान के क्षेत्र में सहायक हो सकता है, साथ ही वास्तविक समय के पानी की निगरानी के माध्यम से रोगजनक जीवाणु संक्रमण के लिए तेजी से, चयनात्मक और संवेदनशील प्रतिक्रिया भी हो सकती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमने अपने आकार और प्रकार के अनुसार निरंतर चलने वाली विधि के आधार पर उच्च गति पर संस्कृति के नमूनों से जीएन बैक्टीरिया को कैप्चर करने और स्थानांतरित करने के लिए एक ध्वनि उत्तोलन माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को कोरियाई सरकार (विज्ञान और आईसीटी मंत्रालय) द्वारा वित्त पोषित नेशनल रिसर्च फाउंडेशन ऑफ कोरिया (एनआरएफ) अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। (नं. एनआरएफ-2021आर1ए2सी1011380)
Materials
| 1 µm polystyrene microbeads | Bang Laboratories | PS04001 | Cell size beads |
| 10 µm Streptavidin-coated microbeads | Bang Laboratories | CP01007 | Aptamer affinity beads |
| 4-inch Silicon Wafer/SU-8 mold | 4science | 29-03573-01 | Components of chip |
| Aptamer | Integrated DNA Technologies | GN3-6' | RNA for bacteria conjugation |
| Borosilicate glass | Schott | BOROFLOAT 33 | Components of chip |
| Centrifuge | Daihan | CF-10 | Wasing particles |
| Cyanoacrylate glue | 3M | AD100 | Attach PZT to microchip |
| Escherichia coli DH5α | KCTC | KCTC2571 | Target bacteria |
| Functional generator | GW Instek | AFG-2225 | Generate frequency |
| High-speed camera | Photron | FASTCAM Mini | Observation of separation |
| Hot plate | As one | HI-1000 | Heating plate for curing of liquid PDMS |
| KOVAX-SYRINGE 10 mL Syringe | Koreavaccine | 22G-10ML | Fill the microfluidic acoustophoresis channel with bubble-free demineralized water. |
| Liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| LB Broth Miller | BD Difco | 244620 | Cell culture (Luria-Bertani medium) |
| Microscope | Olympus Corp. | IX-81 | Observation of separation |
| PBS buffer | Capricorn scientific | PBS-1A | Wasing bacteria |
| PEEK Tubes | Saint-Gobain Ppl Corp. | AAD04103 | Inject or collect particles |
| Piezoelectric transducer | Fuji Ceramics | C-213 | Generate specific wave in channel |
| Power amplifier | Amplifier Research | 75A250A | Amplify frequency |
| Pressure controller/μflucon | AMED | AMED-μflucon | Control of air pressure/flow controller |
| Tris-HCl buffer | invitrogen | 15567027 | Wasing particles |
| Tube rotator | SeouLin Bioscience | SLRM-3 | Modifiying aptamer and bead |
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