Mikrofluidisk akustoforese for gjennomstrømningsseparasjon av gramnegative bakterier ved bruk av aptameraffinitetsperler
Summary
Dette papiret beskriver fabrikasjon og drift av mikrofluidiske akustoforetiske chips ved hjelp av mikrofluidisk akustoforeseteknikk og aptamermodifiserte mikroperler som kan brukes til rask, effektiv isolering av gramnegative bakterier fra et medium.
Abstract
Denne artikkelen beskriver fabrikasjon og drift av mikrofluidiske akustoforetiske sjetonger ved hjelp av en mikrofluidisk akustoforeseteknikk og aptamermodifiserte mikroperler som kan brukes til rask, effektiv isolering av gramnegative bakterier fra et medium. Denne metoden forbedrer separasjonseffektiviteten ved hjelp av en blanding av lange, firkantede mikrokanaler. I dette systemet injiseres prøven og bufferen i innløpsporten gjennom en strømningsregulator. For dråpesentrering og prøveseparasjon påføres vekselstrøm på den piezoelektriske svingeren via en funksjonsgenerator med en effektforsterker for å generere akustisk strålingskraft i mikrokanalen. Det er en todelt kanal ved både innløpet og utløpet, noe som muliggjør samtidig separasjon, rensing og konsentrasjon. Enheten har en utvinningsgrad på >98% og renhet på 97,8% opp til en 10x dosekonsentrasjon. Denne studien har vist en utvinningsgrad og renhet høyere enn de eksisterende metodene for å separere bakterier, noe som tyder på at enheten kan skille bakterier effektivt.
Introduction
Mikrofluidiske plattformer utvikles for å isolere bakterier fra medisinske og miljømessige prøver, i tillegg til metoder basert på dielektrisk overføring, magnetophorese, perleekstraksjon, filtrering, sentrifugalmikrofluidikk og treghetseffekter, og overflateakustiske bølger 1,2. Påvisning av patogene bakterier fortsetter ved bruk av polymerasekjedereaksjon (PCR), men det er vanligvis arbeidskrevende, komplekst og tidkrevende 3,4. Mikrofluidiske akustoforesesystemer er et alternativ for å løse dette gjennom rimelig gjennomstrømning og ikke-kontaktcelleisolasjon 5,6,7. Akustoforese er en teknologi som separerer eller konsentrerer perler ved hjelp av fenomenet materiell bevegelse gjennom en lydbølge. Når lydbølger kommer inn i mikrokanalen, sorteres de i henhold til størrelsen, tettheten etc., av perlene, og celler kan separeres i henhold til de biokjemiske og elektriske egenskapene til suspensjonsmediet 7,8. Følgelig har mange akustoforetiske studier blitt aktivt forfulgt 9,10,11, og nylig har 3D numeriske simuleringer av akustoforetisk bevegelse indusert av grensedrevet akustisk streaming i stående overflate akustisk bølgemikrofluidikk blitt introdusert 12.
Studier på ulike felt undersøker hvordan antistoffer kan erstattes 2,3. Aptamer er et målmateriale med høy selektivitet og spesifisitet, og mange studier gjennomføres 2,9,10,13. Aptamerer har fordeler av liten størrelse, utmerket biologisk stabilitet, lave kostnader og høy reproduserbarhet sammenlignet med antistoffer og studeres i diagnostiske og terapeutiske applikasjoner 2,3,14.
Her beskriver denne artikkelen en mikrofluidisk akustoforeseteknologiprotokoll som kan brukes til rask, effektiv separasjon av gramnegative (GN) bakterier fra et medium ved bruk av aptamermodifiserte mikroperler. Dette systemet genererer en todimensjonal (2D) akustisk stående bølge gjennom enkel piezoelektrisk aktivering ved samtidig å stimulere to ortogonale resonanser i en lang rektangulær mikrokanal for å justere og fokusere aptamerfestede mikroperler ved noden og antinodepunktene for separasjonseffektivitet 2,11,15,16 . Det er en todelt kanal ved både innløpet og utløpet, noe som muliggjør samtidig separasjon, rensing og konsentrasjon.
Denne protokollen kan være nyttig innen tidlig diagnose av bakterielle smittsomme sykdommer, samt en rask, selektiv og sensitiv respons på patogene bakterielle infeksjoner gjennom vannovervåking i sanntid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi utviklet en sonisk levitasjonsmikrofluidisk enhet for fangst og overføring av GN-bakterier fra kulturprøver med høy hastighet basert på en kontinuerlig kjøremetode i henhold til størrelse og type, og aptamermodifiserte mikroperler. Den lange, firkantede mikrokanalen muliggjør en enklere design og større kostnadseffektivitet for 2D-akustoforese enn tidligere rapportert 20,21,22,23,24,25,26.…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Research Foundation of Korea (NRF) stipend finansiert av den koreanske regjeringen (Ministry of Science and ICT). (Nei. NRF-2021R1A2C1011380)
Materials
| 1 µm polystyrene microbeads | Bang Laboratories | PS04001 | Cell size beads |
| 10 µm Streptavidin-coated microbeads | Bang Laboratories | CP01007 | Aptamer affinity beads |
| 4-inch Silicon Wafer/SU-8 mold | 4science | 29-03573-01 | Components of chip |
| Aptamer | Integrated DNA Technologies | GN3-6' | RNA for bacteria conjugation |
| Borosilicate glass | Schott | BOROFLOAT 33 | Components of chip |
| Centrifuge | Daihan | CF-10 | Wasing particles |
| Cyanoacrylate glue | 3M | AD100 | Attach PZT to microchip |
| Escherichia coli DH5α | KCTC | KCTC2571 | Target bacteria |
| Functional generator | GW Instek | AFG-2225 | Generate frequency |
| High-speed camera | Photron | FASTCAM Mini | Observation of separation |
| Hot plate | As one | HI-1000 | Heating plate for curing of liquid PDMS |
| KOVAX-SYRINGE 10 mL Syringe | Koreavaccine | 22G-10ML | Fill the microfluidic acoustophoresis channel with bubble-free demineralized water. |
| Liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| LB Broth Miller | BD Difco | 244620 | Cell culture (Luria-Bertani medium) |
| Microscope | Olympus Corp. | IX-81 | Observation of separation |
| PBS buffer | Capricorn scientific | PBS-1A | Wasing bacteria |
| PEEK Tubes | Saint-Gobain Ppl Corp. | AAD04103 | Inject or collect particles |
| Piezoelectric transducer | Fuji Ceramics | C-213 | Generate specific wave in channel |
| Power amplifier | Amplifier Research | 75A250A | Amplify frequency |
| Pressure controller/μflucon | AMED | AMED-μflucon | Control of air pressure/flow controller |
| Tris-HCl buffer | invitrogen | 15567027 | Wasing particles |
| Tube rotator | SeouLin Bioscience | SLRM-3 | Modifiying aptamer and bead |
References
- Wu, M., et al. Acoustofluidic separation of cells and particles. Microsystem & Nanoengineering. 5 (1), 1-18 (2019).
- Lee, S. W., et al. Aptamer affinity-bead mediated capture and displacement of Gram-negative bacteria using acoustophoresis. Micromachines. 10 (11), 770 (2019).
- Hirvonen, J. J., et al. One-step sample preparation of positive blood cultures for the direct detection of methicillin-sensitive and -resistant Staphylococcus aureus and methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci within one hour using the automated GenomEra CDXTM PCR system. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (10), 2835-2842 (2012).
- Swaminathan, B., Feng, P. Rapid detection of food-borne pathogenic bacteria. Annual Review of Microbiology. 48 (1), 401-426 (1994).
- Ding, X., et al. On-chip manipulation of single microparticles, cells, and organisms using surface acoustic waves. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (28), 11105-11109 (2012).
- Karthick, S., et al. Acoustic impedance-based size independent isolation of circulating tumor cells from blood using acoustophoresis. Lab on a Chip. 18 (24), 2802 (2018).
- Lenshof, A., et al. Acoustofluidics 8: Applications of acoustophoresis in continuous flow microsystems. Lab on a Chip. 12 (7), 1210-1223 (2012).
- Persson, J., et al. Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection. The FEBS journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).
- Klussmann, S. . The aptamer handbook: Functional oligonucleotides and their applications. , (2006).
- Ellington, A., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Namnabat, M. S., et al. 3D numerical simulation of acoustophoretic motion induced by boundary-driven acoustic streaming in standing surface acoustic wave microfluidics. Scientific Reports. 11 (1), 11326 (2021).
- Nimjee, S. M., et al. Aptamer as therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 61-79 (2017).
- Zhang, Y., et al. Recent advances in aptamer discovery and application. Molecules. 24 (5), 941 (2019).
- Park, J. W., et al. Acousto-microfluidics for screening of ssDNA aptamer. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
- Persson, J., et al. Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection. The FEBS Journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).
- Van Toan, N., et al. An investigation of processes for glass micromachining. Micromachines. 7 (3), 51 (2016).
- Jansen, H., et al. A survey on the reactive ion etching of silicon in microtechnology. Journal of Micromechanics and Microengineering. 6 (1), 14 (1996).
- Hanneborg, A., et al. Silicon-to-silicon anodic bonding with a borosilicate glass layer. Journal of Micromechanics and Microengineering. 1 (3), 139 (1991).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnology and bioengineering. 107 (2), 302-311 (2010).
- Wang, S., et al. Simple filter microchip for rapid separation of plasma and viruses from whole blood. International Journal of Nanomedicine. 7, 5019-5028 (2012).
- Ai, Y., et al. Separation of Escherichia coli bacteria from peripheral blood mononuclear cells using standing surface acoustic waves. Analytical Chemistry. 85 (19), 9126-9134 (2013).
- Ohlsson, P., et al. Acoustic impedance matched buffers enable separation of bacteria from blood cells at high cell concentrations. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Park, S., et al. Continuous dielectrophoretic bacterial separation and concentration from physiological media of high conductivity. Lab on a Chip. 11 (17), 2893-2900 (2011).
- Kim, U., Soh, H. T. Simultaneous sorting of multiple bacterial targets using integrated Dielectrophoretic-Magnetic Activated Cell Sorter. Lab on a Chip. 9 (16), 2313-2318 (2009).
- Cai, G., et al. A fluidic device for immunomagnetic separation of foodborne bacteria using self-assembled magnetic nanoparticle chains. Micromachines. 9 (12), 624 (2018).
