Mikrofluidisk akustofores för genomströmningsseparation av gramnegativa bakterier med hjälp av Aptamer Affinity Beads
Summary
Detta papper beskriver tillverkning och drift av mikrofluidiska akustoforetiska chips med hjälp av mikrofluidisk akustoforesteknik och aptamermodifierade mikrober som kan användas för snabb och effektiv isolering av gramnegativa bakterier från ett medium.
Abstract
Denna artikel beskriver tillverkning och drift av mikrofluidiska akustoforetiska chips med hjälp av en mikrofluidisk akustoforesteknik och aptamermodifierade mikrober som kan användas för snabb, effektiv isolering av gramnegativa bakterier från ett medium. Denna metod förbättrar separationseffektiviteten med en blandning av långa, fyrkantiga mikrokanaler. I detta system injiceras provet och bufferten i inloppsporten genom en flödesregulator. För pärlcentrering och provseparation appliceras växelström på den piezoelektriska givaren via en funktionsgenerator med en effektförstärkare för att generera akustisk strålningskraft i mikrokanalen. Det finns en tudelad kanal vid både inlopp och utlopp, vilket möjliggör samtidig separation, rening och koncentration. Enheten har en återvinningsgrad på >98% och renhet på 97,8% upp till en 10x doskoncentration. Denna studie har visat en återvinningsgrad och renhet som är högre än de befintliga metoderna för att separera bakterier, vilket tyder på att enheten kan separera bakterier effektivt.
Introduction
Mikrofluidiska plattformar utvecklas för att isolera bakterier från medicinska och miljöprover, förutom metoder baserade på dielektrisk överföring, magnetofores, pärlextraktion, filtrering, centrifugal mikrofluidik och tröghetseffekter och ytakustiska vågor 1,2. Detektionen av patogena bakterier fortsätter med hjälp av polymeraskedjereaktion (PCR), men det är vanligtvis mödosamt, komplext och tidskrävande 3,4. Mikrofluidiska akustoforessystem är ett alternativ för att hantera detta genom rimlig genomströmning och beröringsfri cellisolering 5,6,7. Akustofores är en teknik som separerar eller koncentrerar pärlor med hjälp av fenomenet materialrörelse genom en ljudvåg. När ljudvågor kommer in i mikrokanalen sorteras de efter pärlornas storlek, densitet etc., och cellerna kan separeras enligtsuspensionsmediets biokemiska och elektriska egenskaper 7,8. Följaktligen har många akustoforetiska studier aktivt bedrivits 9,10,11, och nyligen har 3D-numeriska simuleringar av akustoforetisk rörelse inducerad av gränsdriven akustisk strömning i stående yta akustisk vågmikrofluidik introducerats 12.
Studier inom olika områden undersöker hur man kan ersätta antikroppar 2,3. Aptamer är ett målmaterial med hög selektivitet och specificitet, och många studier genomförs 2,9,10,13. Aptamers har fördelar av liten storlek, utmärkt biologisk stabilitet, låg kostnad och hög reproducerbarhet jämfört med antikroppar och studeras i diagnostiska och terapeutiska tillämpningar 2,3,14.
Här beskriver den här artikeln ett mikrofluidiskt akustoforesteknologiprotokoll som kan användas för snabb, effektiv separation av gramnegativa (GN) bakterier från ett medium med hjälp av aptamermodifierade mikrober. Detta system genererar en tvådimensionell (2D) akustisk stående våg genom enkel piezoelektrisk aktivering genom att samtidigt stimulera två ortogonala resonanser inom en lång rektangulär mikrokanal för att justera och fokusera aptamerbundna mikrober vid nod- och antinodpunkterna för separationseffektivitet 2,11,15,16 . Det finns en tudelad kanal vid både inlopp och utlopp, vilket möjliggör samtidig separation, rening och koncentration.
Detta protokoll kan vara till hjälp inom området för tidig diagnos av bakteriella infektionssjukdomar, liksom ett snabbt, selektivt och känsligt svar på patogena bakterieinfektioner genom vattenövervakning i realtid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi utvecklade en sonisk levitationsmikrofluidikanordning för att fånga och överföra GN-bakterier från odlingsprover med hög hastighet baserat på en kontinuerlig körmetod beroende på deras storlek och typ och aptamermodifierade mikropärlor. Den långa, fyrkantiga mikrokanalen möjliggör en enklare design och större kostnadseffektivitet för 2D-akustofores än tidigare rapporterade 20,21,22,23,24,25,26.<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Research Foundation of Korea (NRF) bidrag finansierat av den koreanska regeringen (ministeriet för vetenskap och IKT). (Nej. NRF-2021R1A2C1011380)
Materials
| 1 µm polystyrene microbeads | Bang Laboratories | PS04001 | Cell size beads |
| 10 µm Streptavidin-coated microbeads | Bang Laboratories | CP01007 | Aptamer affinity beads |
| 4-inch Silicon Wafer/SU-8 mold | 4science | 29-03573-01 | Components of chip |
| Aptamer | Integrated DNA Technologies | GN3-6' | RNA for bacteria conjugation |
| Borosilicate glass | Schott | BOROFLOAT 33 | Components of chip |
| Centrifuge | Daihan | CF-10 | Wasing particles |
| Cyanoacrylate glue | 3M | AD100 | Attach PZT to microchip |
| Escherichia coli DH5α | KCTC | KCTC2571 | Target bacteria |
| Functional generator | GW Instek | AFG-2225 | Generate frequency |
| High-speed camera | Photron | FASTCAM Mini | Observation of separation |
| Hot plate | As one | HI-1000 | Heating plate for curing of liquid PDMS |
| KOVAX-SYRINGE 10 mL Syringe | Koreavaccine | 22G-10ML | Fill the microfluidic acoustophoresis channel with bubble-free demineralized water. |
| Liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| LB Broth Miller | BD Difco | 244620 | Cell culture (Luria-Bertani medium) |
| Microscope | Olympus Corp. | IX-81 | Observation of separation |
| PBS buffer | Capricorn scientific | PBS-1A | Wasing bacteria |
| PEEK Tubes | Saint-Gobain Ppl Corp. | AAD04103 | Inject or collect particles |
| Piezoelectric transducer | Fuji Ceramics | C-213 | Generate specific wave in channel |
| Power amplifier | Amplifier Research | 75A250A | Amplify frequency |
| Pressure controller/μflucon | AMED | AMED-μflucon | Control of air pressure/flow controller |
| Tris-HCl buffer | invitrogen | 15567027 | Wasing particles |
| Tube rotator | SeouLin Bioscience | SLRM-3 | Modifiying aptamer and bead |
References
- Wu, M., et al. Acoustofluidic separation of cells and particles. Microsystem & Nanoengineering. 5 (1), 1-18 (2019).
- Lee, S. W., et al. Aptamer affinity-bead mediated capture and displacement of Gram-negative bacteria using acoustophoresis. Micromachines. 10 (11), 770 (2019).
- Hirvonen, J. J., et al. One-step sample preparation of positive blood cultures for the direct detection of methicillin-sensitive and -resistant Staphylococcus aureus and methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci within one hour using the automated GenomEra CDXTM PCR system. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (10), 2835-2842 (2012).
- Swaminathan, B., Feng, P. Rapid detection of food-borne pathogenic bacteria. Annual Review of Microbiology. 48 (1), 401-426 (1994).
- Ding, X., et al. On-chip manipulation of single microparticles, cells, and organisms using surface acoustic waves. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (28), 11105-11109 (2012).
- Karthick, S., et al. Acoustic impedance-based size independent isolation of circulating tumor cells from blood using acoustophoresis. Lab on a Chip. 18 (24), 2802 (2018).
- Lenshof, A., et al. Acoustofluidics 8: Applications of acoustophoresis in continuous flow microsystems. Lab on a Chip. 12 (7), 1210-1223 (2012).
- Persson, J., et al. Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection. The FEBS journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).
- Klussmann, S. . The aptamer handbook: Functional oligonucleotides and their applications. , (2006).
- Ellington, A., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Namnabat, M. S., et al. 3D numerical simulation of acoustophoretic motion induced by boundary-driven acoustic streaming in standing surface acoustic wave microfluidics. Scientific Reports. 11 (1), 11326 (2021).
- Nimjee, S. M., et al. Aptamer as therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 61-79 (2017).
- Zhang, Y., et al. Recent advances in aptamer discovery and application. Molecules. 24 (5), 941 (2019).
- Park, J. W., et al. Acousto-microfluidics for screening of ssDNA aptamer. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
- Persson, J., et al. Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection. The FEBS Journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).
- Van Toan, N., et al. An investigation of processes for glass micromachining. Micromachines. 7 (3), 51 (2016).
- Jansen, H., et al. A survey on the reactive ion etching of silicon in microtechnology. Journal of Micromechanics and Microengineering. 6 (1), 14 (1996).
- Hanneborg, A., et al. Silicon-to-silicon anodic bonding with a borosilicate glass layer. Journal of Micromechanics and Microengineering. 1 (3), 139 (1991).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnology and bioengineering. 107 (2), 302-311 (2010).
- Wang, S., et al. Simple filter microchip for rapid separation of plasma and viruses from whole blood. International Journal of Nanomedicine. 7, 5019-5028 (2012).
- Ai, Y., et al. Separation of Escherichia coli bacteria from peripheral blood mononuclear cells using standing surface acoustic waves. Analytical Chemistry. 85 (19), 9126-9134 (2013).
- Ohlsson, P., et al. Acoustic impedance matched buffers enable separation of bacteria from blood cells at high cell concentrations. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Park, S., et al. Continuous dielectrophoretic bacterial separation and concentration from physiological media of high conductivity. Lab on a Chip. 11 (17), 2893-2900 (2011).
- Kim, U., Soh, H. T. Simultaneous sorting of multiple bacterial targets using integrated Dielectrophoretic-Magnetic Activated Cell Sorter. Lab on a Chip. 9 (16), 2313-2318 (2009).
- Cai, G., et al. A fluidic device for immunomagnetic separation of foodborne bacteria using self-assembled magnetic nanoparticle chains. Micromachines. 9 (12), 624 (2018).
