Терминальные измерения H-рефлекса у мышей
Summary
Клиническая оценка спастичности на основе рефлекса Гофмана (Н-рефлекса) и с использованием электростимуляции периферических нервов является установленным методом. Здесь мы предлагаем протокол терминальной и прямой стимуляции нерва для количественной оценки H-рефлекса в передней лапе мыши.
Abstract
Рефлекс Гофмана (H-рефлекс), как электрический аналог рефлекса растяжения, позволяет проводить электрофизиологическую проверку целостности нейронных цепей после травм, таких как повреждение спинного мозга или инсульт. Увеличение Н-рефлекторной реакции вместе с такими симптомами, как непроизвольные мышечные сокращения, патологически усиленный рефлекс растяжения и гипертонус в соответствующей мышце, является показателем постинсультной спастичности (PSS).
В отличие от довольно нервно-неспецифических чрескожных измерений, здесь мы представляем протокол количественной оценки Н-рефлекса непосредственно на локтевом и срединном нервах передней лапы, который применим, с небольшими изменениями, к большеберцовому и седалищному нервам задней лапы. Основанный на прямой стимуляции и адаптации к различным нервам, метод представляет собой надежный и универсальный инструмент для проверки электрофизиологических изменений в моделях заболеваний, связанных со спастичностью.
Introduction
Рефлекс Гофмана (H-рефлекс), названный в честь физиолога Пауля Гофмана, может быть вызван электрической стимуляцией периферических нервов, которые несут аксоны сенсорных и двигательных нейронов, возникающих из одних и тех же мышц и ведущих к ним. Он является электрически индуцированным аналогом моносинаптического рефлекса растяжения и имеет тот же путь1. В отличие от растяжения мышц, Н-рефлекс возникает в результате электрической стимуляции. Когда периферические нервы электрически стимулируются при низкой интенсивности тока, афферентные волокна Ia обычно сначала деполяризуются из-за их большого диаметрааксона 2. Их потенциалы действия возбуждают альфа-мотонейроны (αMN) в спинном мозге, которые, в свою очередь, вызывают потенциалы действия, которые перемещаются вниз по аксонам αMN к мышце (рис. 1). Этот каскад генерирует мышечную реакцию с небольшой амплитудой, отраженную в так называемой Н-волне. При постепенном увеличении интенсивности стимула амплитуда зубца Н увеличивается за счет привлечения дополнительных двигательных единиц. От определенной интенсивности стимула потенциалы действия в более тонких аксонах αMN вызываются напрямую, что регистрируется как М-волна. Эта М-волна появляется с меньшей задержкой, чем Н-волна (рис. 2). Если интенсивность стимуляции еще больше увеличивается, амплитуда М-волны становится больше из-за привлечения большего количества аксонов αMN, тогда как зубец Н постепенно уменьшается. Зубец Н может быть подавлен при высокой интенсивности стимула из-за антидромного обратного распространения потенциалов действия в аксонах αMN. Эти триггерные потенциалы действия сталкиваются с потенциалами стимуляции Ia и, таким образом, могут компенсировать друг друга. При супрамаксимальных интенсивностях стимула ортодромные (по направлению к мышцам) и антидромные (по отношению к спинному мозгу) потенциалы действия возникают во всех аксонах MN; первый приводит к максимальной амплитуде М-волны (Mmax), тогда как второй приводит к полной отмене Н-рефлекса3.
Для оценки постинсультной спастичности (PSS) или травмы спинного мозга (SCI) H-рефлекс использовался для оценки нейронной основы движения и спастичности у людей1. Улучшенная количественная оценка изменения Н-рефлекса между измерениями и между испытуемыми достигается за счет использования соотношения Н- и М-волны (отношение Н/М). В качестве альтернативы измеряется депрессия, зависящая от скорости (RDD), с использованием набора восходящих частот (например, 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 и 5,0 Гц). RDD отражает целостность тормозных цепей, которые могут быть нарушены инсультом или ТСМ. Когда все нейронные цепи целы, происходит равномерное, частотно-независимое подавление Н-рефлекса. Однако, если в результате инсульта или ТСМ снижается нервное торможение, подавление Н-рефлекса уменьшается с увеличением частоты стимуляции4.
Правильная электрофизиологическая запись с использованием поверхностных электродов может быть сложной задачей и может зависеть от двигательных задач, тормозных механизмов и возбудимостиαMN 5. При чрескожной записи у грызунов стимулирующий электрод помещают рядом с большеберцовым нервом, а записывающий электрод помещают рядом с соответствующими мышцами передней лапы. Однако, согласно нашему опыту, правильное размещение чрескожных электродов (рис. 1А) у грызунов еще более сложное и изменчивое, чем размещение поверхностных электродов у людей. Это может привести к различиям в длине, частоте и интенсивности стимуляции, необходимых для возникновения Н-рефлекса. Эти методологические проблемы могут объяснить, почему существует лишь очень ограниченное число исследований измерения Н-рефлекса (например, в экспериментальных моделяхинсульта 3,4 и других моделях спастичности6). Точная (долгосрочная) стимуляция и регистрация Н-рефлекса на отдельных нервах в принципе может быть достигнута с помощью имплантируемых электродов, окружающих целевой нерв 7,8. Из-за сложной операции с потенциальными побочными эффектами для животного и потенциальной нестабильностью зонда этот подход не стал стандартом в полевых условиях. Метод, представленный здесь, также требует некоторого хирургического опыта. Тем не менее, он позволяет по-новому, точно стимулировать и регистрировать изолированные нервы in vivo с использованием низкой интенсивности стимуляции, что позволяет избежать одновременной стимуляции соседних нервов.
Protocol
Representative Results
Discussion
В отличие от ранее описанных чрескожных измерений Н-рефлекса у мыши6, мы обеспечиваем более прямое и специфическое для нерва измерение. Этот новый подход может быть применен к нервам передних и задних конечностей (например, срединному, локтевому и лучевому нервам, большебе?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают благодарность Т. Акаю из Университета Далхаузи во время визита М.Г. в его лабораторию. Эта работа была поддержана финансированием Фонда Фрибе (T0498/28960/16) и Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Немецкое научно-исследовательское общество) – Project-ID 431549029 – SFB 1451.
Materials
| Absorbent underpad | VWR | 115-0684 | |
| AD converter | Cambridge Electronic Design, UK | CED 1401micro | |
| Amplifier | Workshop Zoological Institute, UoC | – | |
| Digital stimulator | Workshop Zoological Institute, UoC | MS 501 | |
| EMG electrodes | Workshop Zoological Institute, UoC | Two twisted, insulated copper wires (50 µm outer diameter) were soldered to a male plug and connected to a differential amplifier. | |
| Eye ointment | Bayer | Bepanthen | |
| Glass pipette | Workshop Zoological Institute, UoC | – | Prepare a glass pipette bent into a simple glass hook in the flame of a Bunsen burner. |
| Heating box | MediHeat | MediHeat V1200 | |
| Heating pad | WPI | 61840 Heating pad | |
| Hook electrodes | Workshop Zoological Institute, UoC | – | To produce the electrodes, bend stainless steel miniature pins into hooks at one end and insert into blunt cannulas to create direct mechanical contact. Solder the end of the cannula to copper wires (length approx. 50 cm), which are connected to either stimulation or recording device. |
| Ketamine | Pfizer | Ketavet | |
| Rectal probe | WPI | RET-3 | |
| Stimulator isolation unit | Workshop Zoological Institute, UoC | MI 401 | |
| Sterilizer | CellPoint Scientific | Germinator 500 | Routine pre- and post-operative disinfection of the surgical equipment should be done by heat sterilization. Decontaminate instruments for 15 s in the heated glass bead bath (260°C). |
| Temperature controller | WPI | ATC200 | |
| Vaseline | Bayer | – | |
| Xylazine | Bayer | Rompun |
References
- Palmieri, R. M., Ingersoll, C. D., Hoffman, M. A. The Hoffmann reflex: methodologic considerations and applications for use in sports medicine and athletic training research. Journal of Athletic Training. 39 (3), 268-277 (2004).
- Henneman, E., Somjen, G., Carpenter, D. O. Excitability and inhibitibility of motoneurons of different sizes. Journal of Neurophysiology. 28 (3), 599-620 (1965).
- Toda, T., Ishida, K., Kiyama, H., Yamashita, T., Lee, S. Down-regulation of KCC2 expression and phosphorylation in motoneurons, and increases the number of in primary afferent projections to motoneurons in mice with post-stroke spasticity. PLoS ONE. 9 (12), 114328 (2014).
- Lee, S., Toda, T., Kiyama, H., Yamashita, T. Weakened rate-dependent depression of Hoffmann’s reflex and increased motoneuron hyperactivity after motor cortical infarction in mice. Cell Death & Disease. 5 (1), 1007 (2014).
- Knikou, M. The H-reflex as a probe: Pathways and pitfalls. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 1-12 (2008).
- Wieters, F., et al. Introduction to spasticity and related mouse models. Experimental Neurology. 335, 113491 (2020).
- Pearson, K. G., Acharya, H., Fouad, K. A new electrode configuration for recording electromyographic activity in behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. 148 (1), 36-42 (2005).
- Akay, T. Long-term measurement of muscle denervation and locomotor behavior in individual wild-type and ALS model mice. Journal of Neurophysiology. 111 (3), 694-703 (2014).
- Haghighi, S. S., Green, D. K., Oro, J. J., Drake, R. K., Kracke, G. R. Depressive effect of isoflurane anesthesia on motor evoked potentials. Neurosurgery. 26 (6), 993 (1990).
- Chang, H. -. Y., Havton, L. A. Differential effects of urethane and isoflurane on external urethral sphincter electromyography and cystometry in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 295 (4), 1248-1253 (2008).
- Nolan, J. P. Section 4: Nervous system (Br. J. Pharmacol). Clinical pharmacology. , 295-310 (2012).
- Struck, M. B., Andrutis, K. A., Ramirez, H. E., Battles, A. H. Effect of a short-term fast on ketamine-xylazine anesthesia in rats. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 50 (3), 344-348 (2011).
- Zandieh, S., Hopf, R., Redl, H., Schlag, M. G. The effect of ketamine/xylazine anesthesia on sensory and motor evoked potentials in the rat. Spinal Cord. 41 (1), 16-22 (2003).
