Mediciones terminales del reflejo H en ratones
Summary
La evaluación clínica de la espasticidad basada en el reflejo de Hoffmann (reflejo H) y el uso de estimulación eléctrica de los nervios periféricos es un método establecido. Aquí, proporcionamos un protocolo para una estimulación nerviosa terminal y directa para la cuantificación del reflejo H en la pata delantera del ratón.
Abstract
El reflejo de Hoffmann (reflejo H), como análogo eléctrico del reflejo de estiramiento, permite la validación electrofisiológica de la integridad de los circuitos neuronales después de lesiones como daño de la médula espinal o accidente cerebrovascular. Un aumento de la respuesta del reflejo H, junto con síntomas como contracciones musculares no voluntarias, reflejo de estiramiento patológicamente aumentado e hipertonía en el músculo correspondiente, es un indicador de espasticidad posterior al accidente cerebrovascular (PSS).
En contraste con las mediciones transcutáneas bastante inespecíficas del nervio, aquí presentamos un protocolo para cuantificar el reflejo H directamente en los nervios cubital y mediano de la pata delantera, que es aplicable, con modificaciones menores, al nervio tibial y ciático de la pata posterior. Basado en la estimulación directa y la adaptación a diferentes nervios, el método representa una herramienta fiable y versátil para validar cambios electrofisiológicos en modelos de enfermedades relacionadas con la espasticidad.
Introduction
El reflejo de Hoffmann (reflejo H), llamado así por el fisiólogo Paul Hoffmann, puede ser evocado por la estimulación eléctrica de los nervios periféricos, que transportan axones de neuronas sensoriales y motoras que surgen y conducen a los mismos músculos. Es el análogo inducido eléctricamente del reflejo de estiramiento monosináptico, y comparte la misma vía1. A diferencia del estiramiento muscular, el reflejo H resulta de la estimulación eléctrica. Cuando los nervios periféricos se estimulan eléctricamente a baja intensidad de corriente, las fibras aferentes de Ia generalmente se despolarizan primero debido a su gran diámetro axónico2. Sus potenciales de acción excitan las motoneuronas alfa (αMNs) en la médula espinal, que a su vez provocan potenciales de acción que viajan por los axones αMN hacia el músculo (Figura 1). Esta cascada genera una respuesta muscular con pequeña amplitud, reflejada en la llamada onda H. Al aumentar gradualmente la intensidad del estímulo, la amplitud de la onda H aumenta debido al reclutamiento de unidades motoras adicionales. A partir de una cierta intensidad de estímulo, se obtienen directamente potenciales de acción en los axones más delgados de los αMN, que se registran como la onda M. Esta onda M aparece con una latencia más corta que la onda H (Figura 2). Si la intensidad de la estimulación aumenta aún más, la amplitud de la onda M aumenta debido al reclutamiento de más axones αMN, mientras que la onda H se vuelve gradualmente más pequeña. La onda H puede suprimirse a altas intensidades de estímulo debido a la retropropagación antidrómica de los potenciales de acción en los axones αMN. Estos potenciales de acción activados chocan con los de la estimulación Ia y, por lo tanto, pueden cancelarse entre sí. A intensidades de estímulo supramáximas, se producen potenciales de acción ortodrómicos (hacia el músculo) y antidrómicos (hacia la médula espinal) en todos los axones MN; el primero da lugar a la amplitud máxima de la onda M (Mmax), mientras que el segundo resulta en la abolición completa del reflejo H3.
Para la evaluación de la espasticidad post-accidente cerebrovascular (PSS) o lesión de la médula espinal (LME), el reflejo H se ha utilizado para evaluar las bases neurales del movimiento y la espasticidad en humanos1. Una cuantificación mejorada del cambio en el reflejo H entre mediciones y entre sujetos se logra utilizando la relación de la onda H y M (relación H / M). Alternativamente, se mide la depresión dependiente de la velocidad (RDD), utilizando un conjunto de frecuencias ascendentes (por ejemplo, 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 y 5.0 Hz). La RDD refleja la integridad de los circuitos inhibitorios que pueden ser perturbados por un accidente cerebrovascular o LME. Cuando todos los circuitos neuronales están intactos, hay una supresión uniforme e independiente de la frecuencia del reflejo H. Sin embargo, si hay una inhibición neural reducida como resultado de un accidente cerebrovascular o LME, la supresión del reflejo H disminuye con el aumento de la frecuencia de estimulación4.
El registro electrofisiológico correcto utilizando electrodos de superficie puede ser desafiante y puede verse afectado por tareas motoras, mecanismos inhibitorios y excitabilidad αMN5. En el registro transcutáneo en roedores, se coloca un electrodo de estímulo cerca del nervio tibial y se coloca un electrodo de registro cerca de los músculos relacionados en la pata delantera. Sin embargo, según nuestra experiencia, la colocación correcta de los electrodos transcutáneos (Figura 1A) es aún más compleja y variable en roedores que la colocación de electrodos de superficie en humanos. Esto puede conducir a diferencias en la longitud, frecuencia e intensidad de estimulación necesarias para provocar el reflejo H. Estos desafíos metodológicos podrían explicar por qué solo hay un número muy limitado de estudios de medición del reflejo H (por ejemplo, en modelos experimentales de accidente cerebrovascular 3,4 y otros modelos de espasticidad6. Una estimulación precisa (a largo plazo) y el registro del reflejo H en los nervios individuales podrían, en principio, lograrse utilizando electrodos implantables que rodean el nervio objetivo 7,8. Debido a la cirugía desafiante con posibles efectos secundarios para el animal y la posible inestabilidad de la sonda, este enfoque no se ha convertido en un estándar en el campo. El método presentado aquí también requiere cierta experiencia quirúrgica. Sin embargo, permite una estimulación novedosa y precisa y el registro de nervios aislados in vivo utilizando intensidades de estimulación bajas, lo que evita la estimulación simultánea de los nervios vecinos.
Protocol
Representative Results
Discussion
En contraste con las mediciones transcutáneas del reflejo H descritas anteriormente en el ratón6, proporcionamos una medición más directa y específica del nervio. Este nuevo enfoque se puede aplicar a los nervios de la extremidad anterior y posterior (por ejemplo, los nervios mediano, cubital y radial, y los nervios tibial y ciático, respectivamente), lo que hace que este método sea adaptable como herramienta de diagnóstico a muchos modelos de enfermedades (por ejemplo, accidente cerebrova…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen el apoyo de T. Akay, de la Universidad de Dalhousie, durante una visita de MG a su laboratorio. Este trabajo fue apoyado por la financiación de la Fundación Friebe (T0498/28960/16) y la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) – Project-ID 431549029 – SFB 1451.
Materials
| Absorbent underpad | VWR | 115-0684 | |
| AD converter | Cambridge Electronic Design, UK | CED 1401micro | |
| Amplifier | Workshop Zoological Institute, UoC | – | |
| Digital stimulator | Workshop Zoological Institute, UoC | MS 501 | |
| EMG electrodes | Workshop Zoological Institute, UoC | Two twisted, insulated copper wires (50 µm outer diameter) were soldered to a male plug and connected to a differential amplifier. | |
| Eye ointment | Bayer | Bepanthen | |
| Glass pipette | Workshop Zoological Institute, UoC | – | Prepare a glass pipette bent into a simple glass hook in the flame of a Bunsen burner. |
| Heating box | MediHeat | MediHeat V1200 | |
| Heating pad | WPI | 61840 Heating pad | |
| Hook electrodes | Workshop Zoological Institute, UoC | – | To produce the electrodes, bend stainless steel miniature pins into hooks at one end and insert into blunt cannulas to create direct mechanical contact. Solder the end of the cannula to copper wires (length approx. 50 cm), which are connected to either stimulation or recording device. |
| Ketamine | Pfizer | Ketavet | |
| Rectal probe | WPI | RET-3 | |
| Stimulator isolation unit | Workshop Zoological Institute, UoC | MI 401 | |
| Sterilizer | CellPoint Scientific | Germinator 500 | Routine pre- and post-operative disinfection of the surgical equipment should be done by heat sterilization. Decontaminate instruments for 15 s in the heated glass bead bath (260°C). |
| Temperature controller | WPI | ATC200 | |
| Vaseline | Bayer | – | |
| Xylazine | Bayer | Rompun |
References
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