Misurazioni del riflesso H terminale nei topi
Summary
La valutazione clinica della spasticità basata sul riflesso di Hoffmann (H-reflex) e utilizzando la stimolazione elettrica dei nervi periferici è un metodo consolidato. Qui, forniamo un protocollo per una stimolazione nervosa terminale e diretta per la quantificazione del riflesso H nella zampa anteriore del topo.
Abstract
Il riflesso di Hoffmann (H-reflex), come analogo elettrico del riflesso di allungamento, consente la convalida elettrofisiologica dell’integrità dei circuiti neurali dopo lesioni come danni al midollo spinale o ictus. Un aumento della risposta H-riflessa, insieme a sintomi come contrazioni muscolari non volontarie, riflesso di allungamento patologicamente aumentato e ipertonia nel muscolo corrispondente, è un indicatore di spasticità post-ictus (PSS).
In contrasto con le misurazioni transcutanee piuttosto aspecifiche del nervo, qui, presentiamo un protocollo per quantificare il riflesso H direttamente ai nervi ulnare e mediano della zampa anteriore, che è applicabile, con piccole modifiche, al nervo tibiale e sciatico della zampa posteriore. Basato sulla stimolazione diretta e l’adattamento a diversi nervi, il metodo rappresenta uno strumento affidabile e versatile per convalidare i cambiamenti elettrofisiologici nei modelli di malattia correlati alla spasticità.
Introduction
Il riflesso di Hoffmann (riflesso H), dal nome del fisiologo Paul Hoffmann, può essere evocato dalla stimolazione elettrica dei nervi periferici, che trasportano assoni di neuroni sensoriali e motori che derivano e portano agli stessi muscoli. È l’analogo indotto elettricamente del riflesso di allungamento monosinaptico e condivide lo stesso percorso1. A differenza dell’allungamento muscolare, il riflesso H deriva dalla stimolazione elettrica. Quando i nervi periferici sono stimolati elettricamente a bassa intensità di corrente, le fibre afferenti Ia sono tipicamente depolarizzate prima a causa del loro grande diametro assone2. I loro potenziali d’azione eccitano i motoneuroni alfa (αMN) nel midollo spinale, che a loro volta suscitano potenziali d’azione che viaggiano lungo gli assoni αMN verso il muscolo (Figura 1). Questa cascata genera una risposta muscolare con piccola ampiezza, riflessa nella cosiddetta onda H. Aumentando gradualmente l’intensità dello stimolo, l’ampiezza dell’onda H aumenta a causa del reclutamento di unità motorie aggiuntive. Da una certa intensità di stimolo, i potenziali d’azione negli assoni più sottili degli αMN vengono suscitati direttamente, che viene registrata come onda M. Questa onda M appare con una latenza più breve rispetto all’onda H (Figura 2). Se l’intensità della stimolazione aumenta ulteriormente, l’ampiezza dell’onda M diventa maggiore a causa del reclutamento di più assoni αMN, mentre l’onda H diventa gradualmente più piccola. L’onda H può essere soppressa ad alte intensità di stimolo a causa della retropropagazione antidromica dei potenziali d’azione negli assoni αMN. Questi potenziali d’azione innescati si scontrano con quelli della stimolazione Ia e possono quindi annullarsi a vicenda. A intensità di stimolo sovramassimali, i potenziali d’azione ortodromici (verso il muscolo) e antidromici (verso il midollo spinale) si verificano in tutti gli assoni MN; il primo dà origine all’ampiezza massima dell’onda M (Mmax), mentre il secondo comporta la completa abolizione del riflesso H3.
Per la valutazione della spasticità post-ictus (PSS) o della lesione del midollo spinale (SCI), il riflesso H è stato utilizzato per valutare le basi neurali del movimento e della spasticità nell’uomo1. Una migliore quantificazione della variazione del riflesso H tra le misurazioni e tra i soggetti si ottiene utilizzando il rapporto tra l’onda H e l’onda M (rapporto H/M). In alternativa, viene misurata la depressione dipendente dalla velocità (RDD), utilizzando un insieme di frequenze ascendenti (ad esempio, 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 e 5,0 Hz). L’RDD riflette l’integrità dei circuiti inibitori che possono essere disturbati da ictus o SCI. Quando tutti i circuiti neurali sono intatti, c’è una soppressione uniforme e indipendente dalla frequenza del riflesso H. Tuttavia, se vi è una ridotta inibizione neurale a causa di ictus o SCI, la soppressione del riflesso H diminuisce con l’aumentare della frequenza di stimolazione4.
La corretta registrazione elettrofisiologica mediante elettrodi di superficie può essere difficile e può essere influenzata da compiti motori, meccanismi inibitori ed eccitabilità αMN5. Nella registrazione transcutanea nei roditori, un elettrodo di stimolo viene posizionato vicino al nervo tibiale e un elettrodo di registrazione viene posizionato vicino ai muscoli correlati nella zampa anteriore. Secondo la nostra esperienza, tuttavia, il corretto posizionamento degli elettrodi transcutanei (Figura 1A) è ancora più complesso e variabile nei roditori rispetto al posizionamento degli elettrodi di superficie nell’uomo. Ciò può portare a differenze di lunghezza, frequenza e intensità di stimolazione necessarie per suscitare il riflesso H. Queste sfide metodologiche potrebbero spiegare perché ci sono solo un numero molto limitato di studi di misurazione del riflesso H (ad esempio, nei modelli sperimentali di ictus 3,4 e in altri modelli di spasticità6. Una stimolazione precisa (a lungo termine) e la registrazione del riflesso H sui singoli nervi potrebbero, in linea di principio, essere ottenute utilizzando elettrodi impiantabili che circondano il nervo bersaglio 7,8. A causa dell’impegnativo intervento chirurgico con potenziali effetti collaterali per l’animale e la potenziale instabilità della sonda, questo approccio non è diventato uno standard nel campo. Il metodo qui presentato richiede anche alcune competenze chirurgiche. Tuttavia, consente una stimolazione e una registrazione nuove e precise di nervi isolati in vivo utilizzando basse intensità di stimolazione, che evita la stimolazione simultanea dei nervi vicini.
Protocol
Representative Results
Discussion
A differenza delle misurazioni del riflesso H transcutaneo precedentemente descritte nel topo6, forniamo una misurazione più diretta e specifica per il nervo. Questo nuovo approccio può essere applicato ai nervi dell’arto anteriore e posteriore (ad esempio, i nervi mediano, ulnare e radiale, e i nervi tibiale e sciatico, rispettivamente), rendendo questo metodo adattabile come strumento diagnostico a molti modelli di malattia (ad esempio, ictus, sclerosi multipla, sclerosi laterale amiotrofica, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono con gratitudine il sostegno di T. Akay, Dalhousie University, durante una visita di MG al suo laboratorio. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti della Fondazione Friebe (T0498/28960/16) e della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondazione tedesca per la ricerca) – Project-ID 431549029 – SFB 1451.
Materials
| Absorbent underpad | VWR | 115-0684 | |
| AD converter | Cambridge Electronic Design, UK | CED 1401micro | |
| Amplifier | Workshop Zoological Institute, UoC | – | |
| Digital stimulator | Workshop Zoological Institute, UoC | MS 501 | |
| EMG electrodes | Workshop Zoological Institute, UoC | Two twisted, insulated copper wires (50 µm outer diameter) were soldered to a male plug and connected to a differential amplifier. | |
| Eye ointment | Bayer | Bepanthen | |
| Glass pipette | Workshop Zoological Institute, UoC | – | Prepare a glass pipette bent into a simple glass hook in the flame of a Bunsen burner. |
| Heating box | MediHeat | MediHeat V1200 | |
| Heating pad | WPI | 61840 Heating pad | |
| Hook electrodes | Workshop Zoological Institute, UoC | – | To produce the electrodes, bend stainless steel miniature pins into hooks at one end and insert into blunt cannulas to create direct mechanical contact. Solder the end of the cannula to copper wires (length approx. 50 cm), which are connected to either stimulation or recording device. |
| Ketamine | Pfizer | Ketavet | |
| Rectal probe | WPI | RET-3 | |
| Stimulator isolation unit | Workshop Zoological Institute, UoC | MI 401 | |
| Sterilizer | CellPoint Scientific | Germinator 500 | Routine pre- and post-operative disinfection of the surgical equipment should be done by heat sterilization. Decontaminate instruments for 15 s in the heated glass bead bath (260°C). |
| Temperature controller | WPI | ATC200 | |
| Vaseline | Bayer | – | |
| Xylazine | Bayer | Rompun |
References
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