Terminal H-reflexmätningar hos möss
Summary
Den kliniska utvärderingen av spasticitet baserad på Hoffmannreflexen (H-reflexen) och användning av elektrisk stimulering av perifera nerver är en etablerad metod. Här tillhandahåller vi ett protokoll för en terminal och direkt nervstimulering för H-reflexkvantifiering i musens framtass.
Abstract
Hoffmannreflexen (H-reflexen), som en elektrisk analog till sträckreflexen, möjliggör elektrofysiologisk validering av integriteten hos neurala kretsar efter skador som ryggmärgsskada eller stroke. En ökning av H-reflexsvaret, tillsammans med symtom som icke-frivilliga muskelsammandragningar, patologiskt förstärkt stretchreflex och hypertoni i motsvarande muskel, är en indikator på spasticitet efter stroke (PSS).
I motsats till ganska nervospecifika transkutana mätningar presenterar vi här ett protokoll för att kvantifiera H-reflexen direkt vid framtassens ulnara och mediannerver, vilket är tillämpligt, med mindre modifieringar, på bakpotens tibial- och ischiasnerv. Baserat på direkt stimulering och anpassning till olika nerver representerar metoden ett pålitligt och mångsidigt verktyg för att validera elektrofysiologiska förändringar i spasticitetsrelaterade sjukdomsmodeller.
Introduction
Hoffmannreflexen (H-reflex), uppkallad efter fysiologen Paul Hoffmann, kan framkallas genom elektrisk stimulering av perifera nerver, som bär axoner av sensoriska och motoriska neuroner som härrör från och leder till samma muskler. Det är den elektriskt inducerade analogen av den monosynaptiska sträckreflexen och delar samma väg1. Till skillnad från muskelsträckningen är H-reflexen resultatet av elektrisk stimulering. När perifera nerver stimuleras elektriskt vid låg strömintensitet depolariseras Ia-afferenta fibrer typiskt först på grund av deras stora axondiameter2. Deras aktionspotentialer exciterar alfamotorneuroner (αMN) i ryggmärgen, vilket i sin tur framkallar åtgärdspotentialer som färdas ner αMN-axonerna mot muskeln (figur 1). Denna kaskad genererar ett muskulärt svar med liten amplitud, reflekterad i den så kallade H-vågen. Genom att gradvis öka stimulansintensiteten ökar amplituden för H-vågen på grund av rekryteringen av ytterligare motorenheter. Från en viss stimulansintensitet framkallas åtgärdspotentialer i de tunnare axonerna hos αMN direkt, vilket registreras som M-vågen. Denna M-våg visas med kortare latens än H-vågen (figur 2). Om stimuleringsintensiteten ökas ytterligare blir amplituden för M-vågen större på grund av rekryteringen av fler αMN-axoner, medan H-vågen gradvis blir mindre. H-vågen kan undertryckas vid höga stimulansintensiteter på grund av antidromisk backpropagation av åtgärdspotentialer i αMN-axonerna. Dessa utlösta åtgärdspotentialer kolliderar med dem från Ia-stimuleringen och kan därmed ta ut varandra. Vid supramaximal stimulansintensitet förekommer ortodromiska (mot muskeln) och antidromic (mot ryggmärgen) åtgärdspotentialer i alla MN-axoner; den förra ger upphov till den maximala M-vågamplituden (Mmax), medan den senare resulterar i fullständigt avskaffande av H-reflexen3.
För utvärdering av spasticitet efter stroke (PSS) eller ryggmärgsskada (SCI) har H-reflexen använts för att bedöma den neurala grunden för rörelse och spasticitet hos människa1. En förbättrad kvantifiering av förändringen i H-reflexen mellan mätningar och mellan försökspersoner uppnås genom att använda förhållandet mellan H- och M-vågen (H/M-förhållandet). Alternativt mäts den hastighetsberoende depressionen (RDD) med hjälp av en uppsättning stigande frekvenser (t.ex. 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 och 5,0 Hz). RDD återspeglar integriteten hos hämmande kretsar som kan störas av stroke eller SCI. När alla neurala kretsar är intakta finns det en enhetlig, frekvensoberoende undertryckning av H-reflexen. Men om det finns minskad neural hämning som ett resultat av stroke eller SCI minskar undertryckandet av H-reflexen med ökande stimuleringsfrekvens4.
Korrekt elektrofysiologisk registrering med ytelektroder kan vara utmanande och kan påverkas av motoriska uppgifter, hämmande mekanismer och αMN-retbarhet5. I den transkutana inspelningen hos gnagare placeras en stimulanselektrod nära tibialnerven och en inspelningselektrod placeras nära de relaterade musklerna i frampoten. Enligt vår erfarenhet är dock den korrekta placeringen av de transkutana elektroderna (figur 1A) ännu mer komplex och variabel hos gnagare än ytelektrodplacering hos människor. Detta kan leda till skillnader i längd, frekvens och stimuleringsintensitet som är nödvändig för att framkalla H-reflexen. Dessa metodologiska utmaningar kan förklara varför det endast finns ett mycket begränsat antal H-reflexmätningsstudier (t.ex. i experimentella strokemodeller 3,4 och andra spasticitetsmodeller6. En exakt (långsiktig) stimulering och registrering av H-reflexen på enskilda nerver kan i princip uppnås med hjälp av implanterbara elektroder som omger målnerven 7,8. På grund av den utmanande operationen med potentiella biverkningar för djuret och potentiell instabilitet hos sonden har detta tillvägagångssätt inte blivit en standard inom området. Metoden som presenteras här kräver också viss kirurgisk expertis. Det möjliggör emellertid en ny, exakt stimulering och inspelning av isolerade nerver in vivo med låga stimuleringsintensiteter, vilket undviker samtidig stimulering av närliggande nerver.
Protocol
Representative Results
Discussion
Till skillnad från tidigare beskrivna transkutana H-reflexmätningar i mus6 ger vi en mer direkt och nervspecifik mätning. Detta nya tillvägagångssätt kan tillämpas på nerverna i fram- och bakbenet (t.ex. median-, ulnar- och radialnerverna respektive tibial- respektive ischiasnerverna), vilket gör denna metod anpassningsbar som ett diagnostiskt verktyg till många sjukdomsmodeller (t.ex. stroke, multipel skleros, amyotrofisk lateralskleros, traumatisk hjärnskada och ryggmärgsskada). Bero…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner tacksamt stöd från T. Akay, Dalhousie University, under ett besök av MG till hans labb. Detta arbete stöddes av finansiering från Friebe Foundation (T0498/28960/16) och Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, tyska forskningsstiftelsen) – Project-ID 431549029 – SFB 1451.
Materials
| Absorbent underpad | VWR | 115-0684 | |
| AD converter | Cambridge Electronic Design, UK | CED 1401micro | |
| Amplifier | Workshop Zoological Institute, UoC | – | |
| Digital stimulator | Workshop Zoological Institute, UoC | MS 501 | |
| EMG electrodes | Workshop Zoological Institute, UoC | Two twisted, insulated copper wires (50 µm outer diameter) were soldered to a male plug and connected to a differential amplifier. | |
| Eye ointment | Bayer | Bepanthen | |
| Glass pipette | Workshop Zoological Institute, UoC | – | Prepare a glass pipette bent into a simple glass hook in the flame of a Bunsen burner. |
| Heating box | MediHeat | MediHeat V1200 | |
| Heating pad | WPI | 61840 Heating pad | |
| Hook electrodes | Workshop Zoological Institute, UoC | – | To produce the electrodes, bend stainless steel miniature pins into hooks at one end and insert into blunt cannulas to create direct mechanical contact. Solder the end of the cannula to copper wires (length approx. 50 cm), which are connected to either stimulation or recording device. |
| Ketamine | Pfizer | Ketavet | |
| Rectal probe | WPI | RET-3 | |
| Stimulator isolation unit | Workshop Zoological Institute, UoC | MI 401 | |
| Sterilizer | CellPoint Scientific | Germinator 500 | Routine pre- and post-operative disinfection of the surgical equipment should be done by heat sterilization. Decontaminate instruments for 15 s in the heated glass bead bath (260°C). |
| Temperature controller | WPI | ATC200 | |
| Vaseline | Bayer | – | |
| Xylazine | Bayer | Rompun |
References
- Palmieri, R. M., Ingersoll, C. D., Hoffman, M. A. The Hoffmann reflex: methodologic considerations and applications for use in sports medicine and athletic training research. Journal of Athletic Training. 39 (3), 268-277 (2004).
- Henneman, E., Somjen, G., Carpenter, D. O. Excitability and inhibitibility of motoneurons of different sizes. Journal of Neurophysiology. 28 (3), 599-620 (1965).
- Toda, T., Ishida, K., Kiyama, H., Yamashita, T., Lee, S. Down-regulation of KCC2 expression and phosphorylation in motoneurons, and increases the number of in primary afferent projections to motoneurons in mice with post-stroke spasticity. PLoS ONE. 9 (12), 114328 (2014).
- Lee, S., Toda, T., Kiyama, H., Yamashita, T. Weakened rate-dependent depression of Hoffmann’s reflex and increased motoneuron hyperactivity after motor cortical infarction in mice. Cell Death & Disease. 5 (1), 1007 (2014).
- Knikou, M. The H-reflex as a probe: Pathways and pitfalls. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 1-12 (2008).
- Wieters, F., et al. Introduction to spasticity and related mouse models. Experimental Neurology. 335, 113491 (2020).
- Pearson, K. G., Acharya, H., Fouad, K. A new electrode configuration for recording electromyographic activity in behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. 148 (1), 36-42 (2005).
- Akay, T. Long-term measurement of muscle denervation and locomotor behavior in individual wild-type and ALS model mice. Journal of Neurophysiology. 111 (3), 694-703 (2014).
- Haghighi, S. S., Green, D. K., Oro, J. J., Drake, R. K., Kracke, G. R. Depressive effect of isoflurane anesthesia on motor evoked potentials. Neurosurgery. 26 (6), 993 (1990).
- Chang, H. -. Y., Havton, L. A. Differential effects of urethane and isoflurane on external urethral sphincter electromyography and cystometry in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 295 (4), 1248-1253 (2008).
- Nolan, J. P. Section 4: Nervous system (Br. J. Pharmacol). Clinical pharmacology. , 295-310 (2012).
- Struck, M. B., Andrutis, K. A., Ramirez, H. E., Battles, A. H. Effect of a short-term fast on ketamine-xylazine anesthesia in rats. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 50 (3), 344-348 (2011).
- Zandieh, S., Hopf, R., Redl, H., Schlag, M. G. The effect of ketamine/xylazine anesthesia on sensory and motor evoked potentials in the rat. Spinal Cord. 41 (1), 16-22 (2003).
