Isolatie en profilering van menselijke primaire mesenteriale arteriële endotheelcellen op transcriptoomniveau
Summary
Het protocol beschrijft de isolatie, cultuur en profilering van endotheelcellen uit de menselijke mesenteriale slagader. Daarnaast wordt een methode aangeboden om de menselijke slagader voor te bereiden op ruimtelijke transcriptomics. Proteomics, transcriptomics en functionele assays kunnen worden uitgevoerd op geïsoleerde cellen. Dit protocol kan worden hergebruikt voor elke middelgrote of grote slagader.
Abstract
Endotheelcellen (EC’s) zijn cruciaal voor de vasculaire en lichaamsfunctie door hun dynamische reactie op omgevingssignalen. Het ophelderen van het transcriptoom en epigenoom van EC’s is van het grootste belang om hun rol in ontwikkeling, gezondheid en ziekte te begrijpen, maar is beperkt in de beschikbaarheid van geïsoleerde primaire cellen. Recente technologieën hebben de high-throughput profilering van EC-transcriptoom en epigenoom mogelijk gemaakt, wat heeft geleid tot de identificatie van voorheen onbekende EC-celsubpopulaties en ontwikkelingstrajecten. Hoewel EC-culturen een nuttig hulpmiddel zijn bij het verkennen van EC-functie en disfunctie, kunnen de kweekomstandigheden en meerdere passages externe variabelen introduceren die de eigenschappen van inheemse EC veranderen, waaronder morfologie, epigenetische toestand en genexpressieprogramma. Om deze beperking te overwinnen, demonstreert het huidige artikel een methode om menselijke primaire EC’s te isoleren van donor mesenterische slagaders met als doel hun oorspronkelijke toestand vast te leggen. EC’s in de intimale laag worden mechanisch en biochemisch gedissocieerd met behulp van bepaalde enzymen. De resulterende cellen kunnen direct worden gebruikt voor bulk-RNA of eencellige RNA-sequencing of verguld voor kweek. Daarnaast wordt een workflow beschreven voor de voorbereiding van menselijk arterieel weefsel op ruimtelijke transcriptomics, specifiek voor een commercieel beschikbaar platform, hoewel deze methode ook geschikt is voor andere ruimtelijke transcriptoomprofileringstechnieken. Deze methodologie kan worden toegepast op verschillende vaten verzameld van een verscheidenheid aan donoren in gezondheids- of ziektetoestanden om inzicht te krijgen in EC transcriptionele en epigenetische regulatie, een cruciaal aspect van endotheelcelbiologie.
Introduction
Langs het lumen van bloedvaten zijn endotheelcellen (EC’s) cruciale regulatoren van vasculaire tonus en weefselperfusie. EC’s zijn opmerkelijk in hun vermogen om te reageren op de extracellulaire omgeving en zich aan te passen aan veranderingen in de dynamiek en samenstelling van de bloedstroom. Deze dynamische responsen worden gemedieerd door een netwerk van intracellulaire signaleringsgebeurtenissen, waaronder transcriptionele en post-transcriptionele modulaties met spatio-temporele resolutie. De ontregeling van deze reacties is betrokken bij vele pathologieën, waaronder maar niet beperkt tot hart- en vaatziekten, diabetes en kanker 1,2.
Een groot deel van de studies maakt gebruik van cellijnen of diermodellen om EC-transcriptoom te ondervragen. De eerste is een handig hulpmiddel, gezien het relatieve gebruiksgemak en de goedkoopheid. Seriële kweek kan echter fenotypische veranderingen in EC’s introduceren, zoals fibroblastische kenmerken en een gebrek aan polarisatie, waardoor ze worden losgekoppeld van hun in vivo toestand3. De primaire cellen, bijvoorbeeld human umbilical vein EC (HUVEC) zijn een populaire keuze sinds de jaren 1980, maar zijn afgeleid van een ontwikkelingsvasculair bed dat niet bestaat bij volwassenen, waardoor het onwaarschijnlijk is dat het volwassen EC’s volledig vertegenwoordigt. Dieren, met name muismodellen, vertegenwoordigen beter de fysiologische of pathofysiologische omgeving van EC’s en maken ondervraging van transcriptomen mogelijk als gevolg van genetische verstoring. Murine EC’s kunnen worden geïsoleerd uit verschillende weefsels, waaronder de aorta, longen en vetweefsels met behulp van op enzymen gebaseerde procedures 4,5,6,7. De geïsoleerde cellen kunnen echter niet voor meerdere passages worden gebruikt, tenzij ze6 transformeren en zijn vaak beperkt in aantallen, wat pooling van meerdere dieren vereist 5,8,9.
De komst van nieuwe technologieën die de scheepsarchitectuur op transcriptomisch niveau verkennen, met name met eencellige resolutie, heeft een nieuw tijdperk van endotheelbiologie mogelijk gemaakt door nieuwe functies en eigenschappen van EC’s 5,10,11,12,13,14 te onthullen. Een rijke bron gebouwd door Tabula Muris-onderzoekers verzamelde eencellige transcriptomische profielen van 100.000 cellen, waaronder EC’s in 20 verschillende muizenorganen15, die zowel gemeenschappelijke EC-markergenen als unieke transcriptomische handtekeningen onthulden met inter- en intraweefselverschillen 5,13. Niettemin zijn er duidelijke verschillen tussen muis en mens in genoom, epigenoom en transcriptoom, vooral in de niet-coderende regio’s 16,17,18. Deze bovengenoemde nadelen benadrukken het belang van analyse van EC’s met behulp van menselijke monsters om een getrouw profiel te krijgen van EC’s in hun oorspronkelijke staat in gezondheid en ziekte.
De meeste EC-isolatiemethoden zijn gebaseerd op fysieke dissociatie door homogenisatie, fijnsnijden en fijnsnijden van het weefsel vóór incubatie met proteolytische enzymen gedurende verschillende tijden. De enzymen en aandoeningen variëren ook aanzienlijk tussen weefseltypen, van trypsine tot collagenase, alleen of in combinatie gebruikt 19,20,21. Verdere op antilichamen gebaseerde verrijking of zuivering worden vaak opgenomen om de zuiverheid van EC’s te vergroten. Doorgaans worden antilichamen tegen EC-membraanmarkers, bijvoorbeeld CD144 en CD31, geconjugeerd aan magnetische kralen en toegevoegd aan de celsuspensie22,23. Een dergelijke strategie kan in het algemeen worden aangepast voor EG-isolatie van meerdere menselijke en muizenweefsels, met inbegrip van de in dit protocol geïntroduceerde technieken.
In hun oorspronkelijke toestand interageren EC’s met meerdere celtypen en kunnen ze bestaan in vasculaire niches waar celnabijheid cruciaal is voor de functie. Hoewel single-cell en single-nuclear RNA-sequencing (scRNA en snRNA-seq) studies van het grootste belang zijn geweest voor de recente doorbraken in het beschrijven van EC-heterogeniteit, verstoort het dissociatieproces weefselcontext en cel-celcontact, die ook belangrijk zijn om de EC-biologie te begrijpen. Ontwikkeld in 2012 en uitgeroepen tot Methode van het Jaar in 202024, is ruimtelijke transcriptoomprofilering gebruikt om wereldwijde genexpressie te profileren met behoud van de ruimtelijke kenmerken in verschillende weefsels, waaronder hersenen25, tumor26 en vetweefsel27. De technologieën kunnen worden gericht, met behulp van gespecialiseerde sondes die specifiek zijn voor bepaalde RNA-sequenties die zijn bevestigd aan affiniteitsreagentia of fluorescerende tags, waardoor geselecteerde genen met subcellulaire resolutie 28,29,30,31 worden gedetecteerd. Ze kunnen ook ongericht zijn32,33, meestal met behulp van ruimtelijk barcoded oligonucleotiden om RNA te vangen, die samen worden omgezet in cDNA voor latere seq-bibliotheekvoorbereiding en dus het voordeel hebben dat ze de genexpressie van het hele weefsel op een onbevooroordeelde manier afleiden. Ruimtelijke resolutie wordt momenteel echter niet bereikt op een enkel cellulair niveau met commercieel beschikbare technologieën. Dit kan tot op zekere hoogte worden ondervangen met data-integratie met scRNA-seq-gegevens, waardoor uiteindelijk het in kaart brengen van eencellig transcriptoom in een complexe weefselcontext mogelijk is met behoud van de oorspronkelijke ruimtelijke informatie34.
Hierin wordt een workflow beschreven om EC-transcriptoom te profileren met behulp van menselijke superieure mesenteriale slagader, een perifere slagader die is gebruikt om vaatverwijding, vasculaire remodellering, oxidatieve stress en ontsteking te bestuderen 35,36,37. Twee technieken worden beschreven: 1) om EC’s te isoleren en te verrijken uit de intima van bloedvaten die mechanische dissociatie en enzymatische spijsvertering combineren, geschikt voor eencellige transcriptoomsequencing of daaropvolgende in vitro cultuur; 2) het voorbereiden van arteriële secties voor ruimtelijke transcriptoomprofilering (figuur 1). Deze twee technieken kunnen onafhankelijk of complementair worden uitgevoerd om EC’s en hun omliggende cellen te profileren. Bovendien kan deze workflow worden aangepast voor gebruik op elke middelgrote of grote slagader.
Protocol
Representative Results
Discussion
De gepresenteerde workflow beschrijft een reeks technieken om EC’s te profileren vanuit een enkel stuk menselijke slagader met eencellige en ruimtelijke resolutie. Er zijn verschillende kritische stappen en beperkende factoren in het protocol. Een sleutel tot transcriptoomprofilering is de versheid van het weefsel en de integriteit van het RNA. Het is belangrijk om weefsels zoveel mogelijk op ijs te houden voorafgaand aan de verwerking om RNA-degradatie te minimaliseren. Meestal worden de postmortale weefsels verwerkt tu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies R01HL108735, R01HL145170, R01HL106089 (aan Z.B.C.); DP1DK126138 en DP1HD087990 (naar S.Z.); een Ella Fitzgerald Foundation beurs en een Wanek Family Project (aan Z.B.C.); en een Human Cell Atlas seed network grant (aan Z.B.C. en S.Z.). Onderzoek gerapporteerd in deze publicatie omvatte werk uitgevoerd in de Integrative Genomics Core in City of Hope, ondersteund door het National Cancer Institute van de National Institutes of Health onder toekenningsnummer P30CA033572. De auteurs willen Dr. Ismail Al-Abdullah en Dr. Meirigeng Qi van het eilandjestransplantatieteam van City of Hope bedanken voor de isolatie van menselijke weefsels, Dr. Dongqiang Yuan van City of Hope voor zijn hulp bij scRNA-seq-analyse en Dr. Marc Halushka van de afdeling Cardiovasculaire Pathologie, Johns Hopkins University School of Medicine voor zijn onschatbare inzichten in vasculaire histologie.
Materials
| 1.5 mL micro-centrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 10 cm dish | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 23G needles | BD | 305145 | |
| 2-methylbutane | Thermo Fisher | AC327270010 | |
| 40 µm strainer | Fisher | 14100150 | |
| 4200 TapeStation System | Agilent Technologies | G2991BA | |
| 5 mL tube | Thermo Fisher | 14282300 | |
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 07-000-208 | |
| Attachment factor | Cell Applications | 123-500 | Attachment reagent in the protocol |
| Black wax | Any commercial black wax can be used | ||
| Bovine serum albumin heat shock treated | Fisher | BP1600-100 | |
| CaCl2 | Fisher | BP510 | |
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Chloroform | Fisher | C607 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Cryostat | Leica | ||
| Cryostat brushes | |||
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | MT25950CQC | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | Bacteria-derived protease in the protocol |
| Disposable Safety Scalpels | Myco Instrumentation | 6008TR-10 | |
| D-PBS | Thermo Fisher | 14080055 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Fetal bovine serum | Fisher | 10437028 | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-100g | |
| High sensitivity D1000 sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5603 | |
| High sensitivity D1000 screen tape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| Incubator | Kept at 37 °C 5% CO2 | ||
| Isopropanol | Fisher | BP26324 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2520-10X | |
| Metal cannister | |||
| Microscope | Leica | To assess cell morphology | |
| Microvascular endothelial culture medium | Cell Applications | 111-500 | |
| NaCl | Fisher | S271-1 | |
| New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker | Eppendorf | ||
| Optimal Cutting Temperature compound | Fisher | 4585 | |
| Plastic cryomolds | Fisher | 22363553 | |
| RNA screen tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| RNA screen Tape sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5577 | |
| RNase ZAP | Thermo Fisher | AM9780 | |
| RNase-free water | Takara | RR036B | RNase-free water (2) in kit |
| Sterile 12" long forceps | F.S.T | 91100-16 | |
| Sterile fine forceps | F.S.T | 11050-10 | |
| Sterile fine scissors | F.S.T | 14061-11 | |
| Superfrost PLUS Gold Slides | Fisher | 1518848 | |
| TRIzol reagent | Fisher | 15596018 | |
| Trypan Blue | Corning | MT25900CI | |
| TrypLE Express Enzyme (1X) phenol red | Thermo Fisher | 12605010 | Cell-dissociation enzyme in the protocol |
| Visium Accessory Kit | 10X Genomics | PN-1000215 | |
| Visium Gateway Package, 2rxns | 10X Genomics | PN-1000316 | |
| Visium Spatial Gene Expression Slide & Reagent Kit, 4 rxns | 10X Genomics | PN-1000184 |
References
- Thorin, E., Shreeve, S. M. Heterogeneity of vascular endothelial cells in normal and disease states. Pharmacology & Therapeutics. 78 (3), 155-166 (1998).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
- Hillen, H. F., Melotte, V., van Beijnum, J. R., Griffioen, A. W. Endothelial cell biology. Angiogenesis Assays: A Critical Appraisal of Current Techniques. , 1-38 (2007).
- Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).
- Kalucka, J., et al. Single-cell transcriptome atlas of murine endothelial cells. Cell. 180 (4), 764-779 (2020).
- Tang, X., et al. Suppression of endothelial AGO1 promotes adipose tissue browning and improves metabolic dysfunction. Circulation. 142 (4), 365-379 (2020).
- Ni, C. W., Kumar, S., Ankeny, C. J., Jo, H. Development of immortalized mouse aortic endothelial cell lines. Vascular Cell. 6 (1), 7 (2014).
- Kalluri, A. S., et al. Single-cell analysis of the normal mouse aorta reveals functionally distinct endothelial cell populations. Circulation. 140 (2), 147-163 (2019).
- Wirka, R. C., et al. Atheroprotective roles of smooth muscle cell phenotypic modulation and the TCF21 disease gene as revealed by single-cell analysis. Nature Medicine. 25, 1280-1289 (2019).
- Widyantoro, B., et al. Endothelial cell-derived endothelin-1 promotes cardiac fibrosis in diabetic hearts through stimulation of endothelial-to-mesenchymal transition. Circulation. 121 (22), 2407-2418 (2010).
- Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
- Stuart, T., Satija, R. Integrative single-cell analysis. Nature Reviews Genetics. 20, 257-272 (2019).
- Paik, D. T., et al. Single-cell RNA sequencing unveils unique transcriptomic signatures of organ-specific endothelial cells. Circulation. 142 (19), 1848-1862 (2020).
- Palikuqi, B., et al. Adaptable haemodynamic endothelial cells for organogenesis and tumorigenesis. Nature. 585 (7825), 426-432 (2020).
- The Tabula Muris Consortium. et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Hezroni, H., et al. Principles of long noncoding RNA evolution derived from direct comparison of transcriptomes in 17 species. Cell Reports. 11 (7), 1110-1122 (2015).
- Washietl, S., Kellis, M., Garber, M. Evolutionary dynamics and tissue specificity of human long noncoding RNAs in six mammals. Genome Research. 24 (4), 616-628 (2014).
- Chen, J., et al. Evolutionary analysis across mammals reveals distinct classes of long non-coding RNAs. Genome Biology. 17 (19), 19 (2016).
- Drake, B. L., Loke, Y. W. Isolation of endothelial cells from first trimester decidua using immunomagnetic beads. Human Reproduction. 6, 1156-1159 (1991).
- McDouall, R. M., Yacoub, M., Rose, M. L. Isolation, culture and characterization of MHC class II-positive microvascular endothelial cells from the human heart. Microvascular Research. 51, 137-152 (1996).
- Sokol, L., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: small intestine, colon, heart, and liver. STAR Protocols. 2 (2), 100489 (2021).
- Springhorn, J. P., Madri, J. A., Squinto, S. P. Human capillary endothelial cells from abdominal wall adipose tissue: isolation using an anti-pecam antibody. In Vitro Cellular Developmental Biology Animal. 31 (6), 473-481 (1995).
- Hewett, P. W., Murray, J. C. Immunomagnetic purification of human microvessel endothelial cells using Dynabeads coated with monoclonal antibodies to PECAM-1. European Journal of Cell Biology. 62 (2), 451-454 (1993).
- Marx, V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nature Methods. 18 (1), 9-14 (2021).
- Maynard, K. R., et al. Transcriptome-scale spatial gene expression in the human dorsolateral prefrontal cortex. Nature Neuroscience. 24 (3), 425-436 (2021).
- Ji, A. L., et al. Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma. Cell. 182 (2), 497-514 (2020).
- Bäckdahl, J., et al. Spatial mapping reveals human adipocyte subpopulations with distinct sensitivities to insulin. Cell Metabolism. 33 (9), 1869-1882 (2021).
- Wang, J., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Codeluppi, S., et al. Spatial organization of the somatosensory cortex revealed by osmFISH. Nature Methods. 15, 932-935 (2018).
- Eng, C. H. L., et al. Transcriptome-scale super-resolved imaging in tissues by RNA seqFISH. Nature. 568, 235-239 (2019).
- Eng, C. H. L., Shah, S., Thomassie, J., Cai, L. Profiling the transcriptome with RNA SPOTs. Nature Methods. 14, 1153-1155 (2017).
- Rodriques, S. G., et al. Slide-seq: a scalable technology for measuring genome-wide expression at high spatial resolution. Science. 363 (6434), 1463-1467 (2019).
- Ståhl, P. L., et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science. 353 (6294), 78-82 (2016).
- Rao, A., et al. Exploring tissue architecture using spatial transcriptomics. Nature. 596 (7871), 211-220 (2021).
- Sachidanandam, K., et al. Differential effects of diet-induced dyslipidemia and hyperglycemia on mesenteric resistance artery structure and function in type 2 diabetes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 328 (1), 123-130 (2009).
- Calandrelli, R., et al. Stress-induced RNA-chromatin interactions promote endothelial dysfunction. Nature Communications. 11 (1), 5211 (2020).
- Souza-Smith, F. M., et al. Mesenteric resistance arteries in Type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling. PLoS One. 6 (8), 23337 (2011).
- Asterholm, I., et al. Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling. Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).
- Marin, V., et al. Endothelial cell culture: protocol to obtain and cultivate human umbilical endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 254 (1-2), 183-190 (2001).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single-cell data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
- Hafemeister, C., Satija, R. Normalization and variance stabilization of single-cell RNA-seq data using regularized negative binomial regression. Genome Biology. 20 (1), 296 (2019).
- Bonnycastle, L. L., et al. Single-cell transcriptomics from human pancreatic islets: sample preparation matters. Biology Methods Protocols. 5 (1), (2020).
- Espitia, O., et al. Implication of molecular vascular smooth muscle cell heterogeneity among arterial beds in arterial calcification. PLoS One. 13 (1), 0191976 (2018).
- Engelbrecht, E., et al. Sphingosine 1-phosphate-regulated transcriptomes in heterogenous arterial and lymphatic endothelium of the aorta. eLife. 9, 52690 (2020).
- Hu, H., et al. Single-cell transcriptomic atlas of different human cardiac arteries identifies cell types associated with vascular physiology. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (4), 1408-1427 (2021).
- van Beijnum, J., et al. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Jin, S., et al. Inference and analysis of cell-cell communication using CellChat. Nature Communications. 12 (1), 1088 (2021).
- Efremova, M., Vento-Tormo, M., Teichmann, S. A., Vento-Tormo, R. CellPhoneDB: inferring cell-cell communication from combined expression of multi-subunit ligand-receptor complexes. Nature Protocols. 15 (4), 1484-1506 (2020).
- Hu, Y., Peng, T., Gao, L., Tan, K. CytoTalk: de novo construction of signal transduction networks using single-cell RNA-Seq data. Science Advances. 7 (16), (2020).
- Sanchez-Ferras, O., et al. A coordinated progression of progenitor cell states initiates urinary tract development. Nature Communications. 12 (1), 2627 (2021).
- Mantri, M., et al. Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis. Nature Communications. 12 (1), 1771 (2021).
- Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
- Moffit, J. R., et al. High-throughput MERFISH. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (39), 11046-11051 (2016).
