전사체 수준에서 인간 일차 장간막 동맥 내피 세포의 분리 및 프로파일링
Summary
이 프로토콜은 인간 장간막 동맥으로부터 내피 세포의 분리, 배양 및 프로파일링을 기술한다. 추가적으로, 공간 전사체학을 위한 인간 동맥을 제조하기 위한 방법이 제공된다. 단백체학, 전사체학, 및 기능적 검정은 단리된 세포 상에서 수행될 수 있다. 이 프로토콜은 모든 중간 또는 대형 동맥에 대해 용도를 변경할 수 있습니다.
Abstract
내피 세포 (ECs)는 환경 신호에 대한 역동적 인 반응을 통해 혈관 및 전신 기능에 중요합니다. ECs의 전사체 및 후성 게놈을 밝히는 것은 발달, 건강 및 질병에서 그들의 역할을 이해하는 데 가장 중요하지만 분리 된 일차 세포의 가용성에는 제한적입니다. 최근의 기술들은 EC 전사체 및 에피게놈의 고처리량 프로파일링을 가능하게 하여, 이전에 알려지지 않은 EC 세포 하위집단 및 발달 궤적의 확인으로 이어졌다. EC 배양은 EC 기능 및 기능 장애의 탐구에 유용한 도구이지만, 배양 조건 및 다중 계대는 형태학, 후성 유전 적 상태 및 유전자 발현 프로그램을 포함하여 천연 EC의 특성을 변화시키는 외부 변수를 도입 할 수 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 본 논문은 인간 일차 EC를 기증자 장간막 동맥으로부터 분리하여 본래의 상태를 포획하는 것을 목표로 하는 방법을 시연한다. 내막 층의 EC는 특정 효소의 사용과 함께 기계적, 생화학적으로 해리됩니다. 수득된 세포는 벌크 RNA 또는 단일 세포 RNA 시퀀싱을 위해 직접 사용되거나 배양을 위해 플레이팅될 수 있다. 또한, 공간 전사체학, 특히 상업적으로 이용가능한 플랫폼을 위한 인간 동맥 조직의 제조를 위한 워크플로우가 기술되지만, 이 방법은 다른 공간 전사체 프로파일링 기술에도 적합하다. 이 방법론은 내피 세포 생물학의 중추적 인 측면 인 EC 전사 및 후성 유전 적 조절에 대한 통찰력을 얻기 위해 건강 또는 질병 상태의 다양한 기증자로부터 수집 된 다른 혈관에 적용될 수 있습니다.
Introduction
혈관의 내강을 감싸는 내피 세포 (ECs)는 혈관 색조 및 조직 관류의 중요한 조절자입니다. EC는 세포 외 환경에 반응하고 혈류의 역학 및 구성의 변화에 적응하는 능력이 뛰어납니다. 이러한 동적 반응은 시공간적 분해능을 갖는 전사 및 전사 후 조절을 포함하는 세포내 신호전달 사건의 네트워크를 통해 매개된다. 이러한 반응의 조절 장애는 심혈관 질환, 당뇨병 및 암 1,2를 포함하되 이에 국한되지 않는 많은 병리에 연루되어 있습니다.
많은 연구가 EC 전사체를 조사하기 위해 세포주 또는 동물 모델을 사용합니다. 전자는 상대적으로 사용하기 쉽고 저렴하다는 점을 감안할 때 유용한 도구입니다. 그러나, 연속 배양은 섬유아세포의 특징과 분극의 부족과 같은 ECs에 표현형 변화를 도입하여 생체내 상태(3)로부터 분리시킬 수 있다. 일차 세포, 예를 들어, 인간 탯줄 정맥 EC (HUVEC)는 1980 년대부터 대중적인 선택이었지만 성인에는 존재하지 않는 발달 혈관 층에서 파생되므로 성숙한 EC를 완전히 대표하지는 않을 것입니다. 동물, 특히 마우스 모델은 ECs의 생리적 또는 병리생리학적 환경을 더 잘 나타내며 유전적 교란의 결과로 전사체의 심문을 허용한다. 뮤 린 ECs는 효소 기반 절차 4,5,6,7을 사용하여 대동맥, 폐 및 지방 조직을 포함한 다양한 조직으로부터 분리될 수 있다. 그러나, 단리된세포는 형질전환6이 아니라면 다중 계대에 사용될 수 없으며, 종종 그 수가 제한되며, 이는 다수의 동물 5,8,9로부터의 풀링을 필요로 한다.
전사체 수준, 특히 단일 세포 분해능을 통해 혈관 구조를 탐구하는 새로운 기술의 출현은 ECs 5,10,11,12,13,14의 새로운 기능과 특성을 밝혀냄으로써 내피 생물학의 새로운 시대를 열었습니다. Tabula Muris 조사관이 구축 한 풍부한 자원은 20 개의 다른 뮤린 기관15에 걸쳐 EC를 포함한 100,000 개의 세포의 단일 세포 전사체 프로파일을 수집하여 일반적인 EC 마커 유전자와 조직 간 및 조직 내 차이가있는 고유 한 전사체 서명 5,13을 밝혀 냈습니다. 그럼에도 불구하고, 게놈, 에피게놈 및 전사체, 특히 비코딩 영역16,17,18에서 마우스와 인간 사이에 분명한 차이가 있다. 앞서 언급 한 이러한 단점은 건강 및 질병에서 기본 상태에서 EC의 충실한 프로파일을 얻기 위해 인간 샘플을 사용하여 EC를 분석하는 것이 중요하다는 것을 강조합니다.
대부분의 EC 분리 방법은 단백질 분해 효소로 인큐베이션하기 전에 조직을 균질화, 미세하게 절단 및 다듬어 다른 시간 동안 물리적 해리에 의존합니다. 효소 및 조건은 또한 트립신에서 콜라게나제에 이르기까지 조직 유형마다 상당히 다양하며, 단독으로 또는 조합하여 사용되는 19,20,21이다. 추가의 항체-기반 농축 또는 정제는 종종 ECs의 순도를 증가시키기 위해 포함된다. 전형적으로, EC 막 마커, 예를 들어, CD144 및 CD31에 대한 항체는 자성 비드에 접합되고 세포 현탁액22,23에 첨가된다. 이러한 전략은 일반적으로 이 프로토콜에 도입된 기술을 포함하여 다수의 인간 및 마우스 조직으로부터의 EC 단리를 위해 적응될 수 있다.
EC는 원래 상태에서 여러 세포 유형과 상호 작용하며 세포 근접성이 기능에 중요한 혈관 틈새 시장에 존재할 수 있습니다. 단일 세포 및 단일 핵 RNA-시퀀싱 (scRNA 및 snRNA-seq) 연구가 EC 이질성을 설명하는 데있어 최근의 돌파구에 가장 중요했지만, 해리 과정은 조직 맥락과 세포 – 세포 접촉을 방해하며, 이는 EC 생물학을 이해하는 데에도 중요합니다. 2012년에 개발되어 2020년 24년에 올해의 방법(Method of the Year)으로 명명된 공간 전사체 프로파일링은 뇌(25), 종양(26), 지방조직(27)을 포함한 다양한 조직에서의 공간적 특징을 유지하면서 글로벌 유전자 발현을 프로파일링하는 데 활용되고 있다. 이 기술은 친화성 시약 또는 형광 태그에 부착 된 특정 RNA 서열에 특이적인 특수 프로브를 사용하여 타겟팅 할 수 있으므로 세포 내 해상도 28,29,30,31에서 선택된 유전자를 검출 할 수 있습니다. 이들은 또한 비표적화된32,33일 수 있으며, 전형적으로 공간적으로 바코드된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 RNA를 포획할 수 있으며, 이는 함께 후속 서열 라이브러리 제조를 위해 cDNA로 전환되고, 따라서 편향되지 않은 방식으로 전체 조직 유전자 발현을 추론하는 이점을 갖는다. 그러나, 공간 분해능은 현재 상업적으로 이용가능한 기술로 단일 세포 수준에서 달성되지 않는다. 이것은 scRNA-seq 데이터와의 데이터 통합으로 어느 정도 극복될 수 있으며, 궁극적으로는 원래의 공간 정보(34)를 유지하면서 복잡한 조직 컨텍스트에서 단일 세포 전사체의 매핑을 허용한다.
본원에서, 워크플로우는 인간 우수한 장간막 동맥, 혈관확장, 혈관 리모델링, 산화 스트레스, 및 염증35,36,37을 연구하는데 사용되어 온 말초 동맥을 사용하여 EC 전사체를 프로파일링하기 위해 기술된다. 두 가지 기술이 기재되어 있다: 1) 단일 세포 전사체 시퀀싱 또는 후속 시험관내 배양에 적합한 기계적 해리 및 효소적 소화를 결합하는 혈관의 내막으로부터 ECs를 단리하고 풍부하게 하는 단계; 2) 공간 전사체 프로파일링을 위한 동맥 절편을 준비한다(도 1). 이 두 기술은 EC와 그 주변 셀을 프로파일링하기 위해 독립적으로 또는 상보적으로 수행될 수 있습니다. 또한이 워크 플로는 모든 중간 또는 대형 동맥에서 사용하도록 조정할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제시된 워크플로우에서는 단일 세포 및 공간 분해능을 사용하여 단일 인간 동맥에서 EC를 프로파일링하는 일련의 기술에 대해 자세히 설명합니다. 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계와 제한 요소가 있습니다. 전사체 프로파일링의 한 가지 핵심은 조직의 신선도와 RNA 무결성입니다. RNA 분해를 최소화하기 위해 처리하기 전에 가능한 한 많은 얼음 위에 조직을 유지하는 것이 중요합니다. 전형적으?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 NIH 보조금 R01HL108735, R01HL145170, R01HL106089 (Z.B.C.)에 의해 지원되었습니다. DP1DK126138 및 DP1HD087990 (하기 S.Z.); 엘라 피츠제럴드 재단 보조금과 와넥 가족 프로젝트 (Z.B.C.); 및 인간 세포 아틀라스 시드 네트워크 그랜트 (Z.B.C. 및 S.Z.에). 이 간행물에보고 된 연구에는 City of Hope의 통합 유전체학 코어에서 수상 번호 P30CA033572로 국립 보건원 국립 암 연구소가 지원하는 작업이 포함되었습니다. 저자들은 인간 조직의 격리를 위해 City of Hope의 섬 이식 팀의 Ismail Al-Abdullah 박사와 Meirigeng Qi 박사, scRNA-seq 분석에 도움을 준 City of Hope의 Dongqiang Yuan 박사, Johns Hopkins University School of Medicine의 심혈관 병리학 부서의 Marc Halushka 박사에게 혈관 조직학에 대한 귀중한 통찰력에 감사드립니다.
Materials
| 1.5 mL micro-centrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 10 cm dish | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 23G needles | BD | 305145 | |
| 2-methylbutane | Thermo Fisher | AC327270010 | |
| 40 µm strainer | Fisher | 14100150 | |
| 4200 TapeStation System | Agilent Technologies | G2991BA | |
| 5 mL tube | Thermo Fisher | 14282300 | |
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 07-000-208 | |
| Attachment factor | Cell Applications | 123-500 | Attachment reagent in the protocol |
| Black wax | Any commercial black wax can be used | ||
| Bovine serum albumin heat shock treated | Fisher | BP1600-100 | |
| CaCl2 | Fisher | BP510 | |
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Chloroform | Fisher | C607 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Cryostat | Leica | ||
| Cryostat brushes | |||
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | MT25950CQC | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | Bacteria-derived protease in the protocol |
| Disposable Safety Scalpels | Myco Instrumentation | 6008TR-10 | |
| D-PBS | Thermo Fisher | 14080055 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Fetal bovine serum | Fisher | 10437028 | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-100g | |
| High sensitivity D1000 sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5603 | |
| High sensitivity D1000 screen tape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| Incubator | Kept at 37 °C 5% CO2 | ||
| Isopropanol | Fisher | BP26324 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2520-10X | |
| Metal cannister | |||
| Microscope | Leica | To assess cell morphology | |
| Microvascular endothelial culture medium | Cell Applications | 111-500 | |
| NaCl | Fisher | S271-1 | |
| New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker | Eppendorf | ||
| Optimal Cutting Temperature compound | Fisher | 4585 | |
| Plastic cryomolds | Fisher | 22363553 | |
| RNA screen tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| RNA screen Tape sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5577 | |
| RNase ZAP | Thermo Fisher | AM9780 | |
| RNase-free water | Takara | RR036B | RNase-free water (2) in kit |
| Sterile 12" long forceps | F.S.T | 91100-16 | |
| Sterile fine forceps | F.S.T | 11050-10 | |
| Sterile fine scissors | F.S.T | 14061-11 | |
| Superfrost PLUS Gold Slides | Fisher | 1518848 | |
| TRIzol reagent | Fisher | 15596018 | |
| Trypan Blue | Corning | MT25900CI | |
| TrypLE Express Enzyme (1X) phenol red | Thermo Fisher | 12605010 | Cell-dissociation enzyme in the protocol |
| Visium Accessory Kit | 10X Genomics | PN-1000215 | |
| Visium Gateway Package, 2rxns | 10X Genomics | PN-1000316 | |
| Visium Spatial Gene Expression Slide & Reagent Kit, 4 rxns | 10X Genomics | PN-1000184 |
References
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