Isolierung und Profilierung humaner primärer mesenterialer arterieller Endothelzellen auf Transkriptomebene

Summary

Das Protokoll beschreibt die Isolierung, Kultur und Profilierung von Endothelzellen aus der menschlichen Mesenterialarterie. Zusätzlich wird eine Methode zur Vorbereitung der menschlichen Arterie für die räumliche Transkriptomik bereitgestellt. Proteomik, Transkriptomik und funktionelle Assays können an isolierten Zellen durchgeführt werden. Dieses Protokoll kann für jede mittelgroße oder große Arterie wiederverwendet werden.

Abstract

Endothelzellen (ECs) sind durch ihre dynamische Reaktion auf Umwelteinflüsse entscheidend für die Gefäß- und Ganzkörperfunktion. Die Aufklärung des Transkriptoms und Epigenoms von ECs ist von größter Bedeutung, um ihre Rolle bei Entwicklung, Gesundheit und Krankheit zu verstehen, ist jedoch in der Verfügbarkeit isolierter Primärzellen begrenzt. Jüngste Technologien haben die Hochdurchsatzprofilierung von EC-Transkriptom und Epigenom ermöglicht, was zur Identifizierung bisher unbekannter EC-Zellsubpopulationen und Entwicklungsverläufe geführt hat. Während EC-Kulturen ein nützliches Werkzeug bei der Erforschung von EC-Funktion und -Dysfunktion sind, können die Kulturbedingungen und mehrere Passagen externe Variablen einführen, die die Eigenschaften des nativen EC verändern, einschließlich Morphologie, epigenetischer Zustand und Genexpressionsprogramm. Um diese Einschränkung zu überwinden, demonstriert die vorliegende Arbeit eine Methode zur Isolierung menschlicher primärer ECs aus Spender-Mesenterialarterien, die darauf abzielt, ihren ursprünglichen Zustand zu erfassen. ECs in der intimen Schicht werden mechanisch und biochemisch unter Verwendung bestimmter Enzyme dissoziiert. Die resultierenden Zellen können direkt für die Bulk-RNA- oder Einzelzell-RNA-Sequenzierung verwendet oder für die Kultur plattiert werden. Darüber hinaus wird ein Workflow für die Präparation von menschlichem arteriellem Gewebe für die räumliche Transkriptomik, speziell für eine kommerziell erhältliche Plattform, beschrieben, obwohl diese Methode auch für andere räumliche Transkriptom-Profiling-Techniken geeignet ist. Diese Methodik kann auf verschiedene Gefäße angewendet werden, die von einer Vielzahl von Spendern in Gesundheits- oder Krankheitszuständen gesammelt wurden, um Einblicke in die transkriptionelle und epigenetische Regulation der EG zu erhalten, ein zentraler Aspekt der Endothelzellbiologie.

Introduction

Endothelzellen (ECs), die das Lumen der Blutgefäße auskleiden, sind entscheidende Regulatoren des Gefäßtonus und der Gewebedurchblutung. ECs sind bemerkenswert in ihrer Fähigkeit, auf die extrazelluläre Umgebung zu reagieren und sich an Veränderungen in der Dynamik und Zusammensetzung des Blutflusses anzupassen. Diese dynamischen Reaktionen werden durch ein Netzwerk von intrazellulären Signalereignissen vermittelt, einschließlich transkriptioneller und posttranskriptioneller Modulationen mit räumlich-zeitlicher Auflösung. Die Dysregulation dieser Reaktionen ist an vielen Pathologien beteiligt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Diabetes und Krebs ^1,2.

Ein großer Teil der Studien verwendet Zelllinien oder Tiermodelle, um das EC-Transkriptom abzufragen. Ersteres ist ein nützliches Werkzeug, angesichts der relativen Benutzerfreundlichkeit und Preiswertigkeit. Die serielle Kultivierung kann jedoch phänotypische Veränderungen an ECs einführen, wie z. B. fibroblastische Merkmale und einen Mangel an Polarisation, wodurch sie von ihrem In-vivo-Zustand ^{getrennt werden 3}. Die Primärzellen, z. B. die menschliche Nabelvene EC (HUVEC), sind seit den 1980er Jahren eine beliebte Wahl, stammen jedoch aus einem entwicklungsbedingten Gefäßbett, das bei Erwachsenen nicht existiert und daher wahrscheinlich nicht vollständig reife ECs darstellt. Tiere, insbesondere Mausmodelle, bilden die physiologische oder pathophysiologische Umgebung von EC besser ab und erlauben die Abfrage von Transkriptomen als Folge genetischer Störungen. Murine ECs können aus verschiedenen Geweben, einschließlich der Aorta, der Lunge und des Fettgewebes, mit enzymbasierten Verfahren 4,5,6,7 isoliert werden. Die isolierten Zellen können jedoch nicht für mehrere Passagen verwendet werden, es sei denn,^{sie sind transformiert 6} und sind oft in der Anzahl begrenzt, was eine Bündelung von mehreren Tieren^erfordert 5,8,9.

Das Aufkommen neuer Technologien, die die Gefäßarchitektur auf transkriptomischer Ebene erforschen, insbesondere mit Einzelzellauflösung, hat eine neue Ära der Endothelbiologie ermöglicht, indem sie neue Funktionen und Eigenschaften der ECs 5,10,11,12,13,14 enthüllt hat. Eine reichhaltige Ressource, die von Tabula Muris-Forschern erstellt wurde, sammelte einzelzellige transkriptomische Profile von 100.000 Zellen, einschließlich ECs in 20 verschiedenen murinen Organen¹⁵, die sowohl gemeinsame EC-Markergene als auch einzigartige transkriptomische Signaturen mit Inter- und Intragewebeunterschieden^{zeigten 5,13}. Dennoch gibt es deutliche Unterschiede zwischen Maus und Mensch in Genom, Epigenom und Transkriptom, insbesondere in den nicht-kodierenden Regionen^16,17,18. Diese oben genannten Nachteile unterstreichen die Bedeutung der Analyse von ECs unter Verwendung menschlicher Proben, um ein getreues Profil von ECs in ihrem Heimatzustand in Gesundheit und Krankheit zu erhalten.

Die meisten EC-Isolationsmethoden beruhen auf der physikalischen Dissoziation durch Homogenisierung, feines Schneiden und Zerkleinern des Gewebes vor der Inkubation mit proteolytischen Enzymen für unterschiedliche Zeiten. Die Enzyme und Bedingungen variieren auch erheblich zwischen den Gewebetypen, von Trypsin bis Kollagenase, die allein oder in Kombination verwendet werden 19,20,21. Weitere Antikörper-basierte Anreicherung oder Reinigung sind oft enthalten, um die Reinheit von ECs zu erhöhen. Typischerweise werden Antikörper gegen EC-Membranmarker, z. B. CD144 und CD31, an magnetische Kügelchen konjugiert und der Zellsuspension^22,23 zugesetzt. Eine solche Strategie kann im Allgemeinen für die EG-Isolierung aus mehreren menschlichen und Mausgeweben angepasst werden, einschließlich der in diesem Protokoll eingeführten Techniken.

In ihrem nativen Zustand interagieren ECs mit mehreren Zelltypen und können in vaskulären Nischen existieren, in denen die Zellnähe für die Funktion entscheidend ist. Während Einzelzell- und Einzelkern-RNA-Sequenzierungsstudien (scRNA und snRNA-seq) für die jüngsten Durchbrüche bei der Beschreibung der EC-Heterogenität von größter Bedeutung waren, stört der Dissoziationsprozess den Gewebekontext und den Zell-Zell-Kontakt, die auch für das Verständnis der EC-Biologie wichtig sind. Das 2012 entwickelte und^{2020 24} zur Methode des Jahres ernannte räumliche Transkriptomprofilierung wurde verwendet, um die globale Genexpression zu profilieren und gleichzeitig die räumlichen Merkmale in verschiedenen Geweben einschließlich Gehirn 25, Tumor²⁶ und Fettgewebe²⁷ beizubehalten. Die Technologien können gezielt eingesetzt werden, indem spezielle Sonden verwendet werden, die für bestimmte RNA-Sequenzen spezifisch sind, die an Affinitätsreagenzien oder fluoreszierenden Tags befestigt sind, wodurch ausgewählte Gene mit subzellulärer Auflösung 28,29,30,31 nachgewiesen werden. Sie können auch ungezielt^32,33 sein, typischerweise mit räumlich barcodierten Oligonukleotiden, um RNA zu fangen, die zusammen in cDNA für die anschließende Seq-Bibliotheksvorbereitung umgewandelt werden und daher den Vorteil haben^, die Genexpression des gesamten Gewebes auf unvoreingenommene Weise abzuleiten. Allerdings wird die räumliche Auflösung derzeit auf einer einzigen zellulären Ebene mit kommerziell verfügbaren Technologien nicht erreicht. Dies kann bis zu einem gewissen Grad durch die Datenintegration mit scRNA-seq-Daten überwunden werden, was letztendlich die Kartierung von Einzelzelltranskriptomen in einem komplexen Gewebekontext unter Beibehaltung seiner ursprünglichen räumlichen Informationen^{ermöglicht 34}.

Hierin wird ein Workflow beschrieben, um ein EC-Transkriptom unter Verwendung der humanen oberen Mesenterialarterie zu profilieren, einer peripheren Arterie, die zur Untersuchung von Vasodilatation, Gefäßumbau, oxidativem Stress und Entzündung^{verwendet wurde 35,36,37}. Es werden zwei Techniken beschrieben: 1) zur Isolierung und Anreicherung von ECs aus der Intima von Blutgefäßen, die mechanische Dissoziation und enzymatische Verdauung kombinieren, die für die Einzelzell-Transkriptomsequenzierung oder die anschließende In-vitro-Kultur geeignet sind; 2) zur Vorbereitung von arteriellen Schnitten für die räumliche Transkriptomprofilerstellung (Abbildung 1). Diese beiden Techniken können unabhängig voneinander oder komplementär durchgeführt werden, um ECs und ihre umgebenden Zellen zu profilieren. Darüber hinaus kann dieser Workflow für den Einsatz an jeder mittleren oder großen Arterie angepasst werden.

Protocol

Studien an menschlichem Gewebe wurden an deidentifizierten Proben durchgeführt, die vom Southern California Islet Cell Resource Center in der Stadt der Hoffnung erhalten wurden. Die Forschungszustimmungen für die Verwendung von postmortalem menschlichem Gewebe wurden von den nächsten Angehörigen der Spender eingeholt, und die ethische Genehmigung für diese Studie wurde vom Institutional Review Board of City of Hope (IRB Nr. 01046) erteilt. 1. Physikalische Dissoziation (geschätzte …

Representative Results

Die Analyse von ECs aus der Arteria mesenterica unter Verwendung einer Kombination aus mechanischer und enzymatischer Dissoziation oder Kryokonservierung zur Verwendung in verschiedenen nachgeschalteten Assays ist hier dargestellt (Abbildung 1). ECs können in Mesenterialarterien mit den folgenden Schritten profiliert werden: A) mechanische Dissoziation von der Intima in Verbindung mit Kollagenase-Verdauung zu Kulturzellen; B) Erzeugung von Einzelzellsuspension für scRNA-seq; oder C) Quersc…

Discussion

Der vorgestellte Workflow beschreibt eine Reihe von Techniken zum Profilieren von ECs aus einem einzelnen Stück menschlicher Arterie mit Einzelzell- und räumlicher Auflösung. Es gibt mehrere kritische Schritte und einschränkende Faktoren im Protokoll. Ein Schlüssel zur Transkriptomprofilierung ist die Frische des Gewebes und die RNA-Integrität. Es ist wichtig, das Gewebe vor der Verarbeitung so weit wie möglich auf Eis zu halten, um den RNA-Abbau zu minimieren. Typischerweise werden die postmortalen Gewebe zwische…

Materials

1.5 mL micro-centrifuge tube	USA Scientific	1615-5500
10 cm dish	Genesee Scientific	25-202
23G needles	BD	305145
2-methylbutane	Thermo Fisher	AC327270010
40 µm strainer	Fisher	14100150
4200 TapeStation System	Agilent Technologies	G2991BA
5 mL tube	Thermo Fisher	14282300
6-well plate	Greiner Bio-One	07-000-208
Attachment factor	Cell Applications	123-500	Attachment reagent in the protocol
Black wax			Any commercial black wax can be used
Bovine serum albumin heat shock treated	Fisher	BP1600-100
CaCl2	Fisher	BP510
Centrifuge	Eppendorf
Chloroform	Fisher	C607
Collagenase D	Roche	11088866001
Cryostat	Leica
Cryostat brushes
D-Glucose	Fisher	D16-1
Dimethyl sulfoxide	Fisher	MT25950CQC
Dispase II	Roche	4942078001	Bacteria-derived protease in the protocol
Disposable Safety Scalpels	Myco Instrumentation	6008TR-10
D-PBS	Thermo Fisher	14080055
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Fetal bovine serum	Fisher	10437028
Hemocytometer	Fisher	267110
HEPES	Sigma Aldrich	H3375-100g
High sensitivity D1000 sample buffer	Agilent Technologies	5067-5603
High sensitivity D1000 screen tape	Agilent Technologies	5067-5584
Incubator			Kept at 37 °C 5% CO2
Isopropanol	Fisher	BP26324
KCl	Fisher	P217-3
Liquid nitrogen
Medium 199	Sigma Aldrich	M2520-10X
Metal cannister
Microscope	Leica		To assess cell morphology
Microvascular endothelial culture medium	Cell Applications	111-500
NaCl	Fisher	S271-1
New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker	Eppendorf
Optimal Cutting Temperature compound	Fisher	4585
Plastic cryomolds	Fisher	22363553
RNA screen tape	Agilent Technologies	5067-5576
RNA screen Tape sample buffer	Agilent Technologies	5067-5577
RNase ZAP	Thermo Fisher	AM9780
RNase-free water	Takara	RR036B	RNase-free water (2) in kit
Sterile 12" long forceps	F.S.T	91100-16
Sterile fine forceps	F.S.T	11050-10
Sterile fine scissors	F.S.T	14061-11
Superfrost PLUS Gold Slides	Fisher	1518848
TRIzol reagent	Fisher	15596018
Trypan Blue	Corning	MT25900CI
TrypLE Express Enzyme (1X) phenol red	Thermo Fisher	12605010	Cell-dissociation enzyme in the protocol
Visium Accessory Kit	10X Genomics	PN-1000215
Visium Gateway Package, 2rxns	10X Genomics	PN-1000316
Visium Spatial Gene Expression Slide & Reagent Kit, 4 rxns	10X Genomics	PN-1000184