I denne protokol anvendes et biomimetisk mikrofluidassay, som kan reproducere et fysiologisk relevant mikrovaskulært miljø og reproducere hele leukocytadhæsionen / migrationskaskaden, til at studere leukocyt-endotelcelleinteraktioner i inflammatorisk sygdom.
Leukocyt-endotelcelleinteraktioner spiller en vigtig rolle i inflammatoriske sygdomme som sepsis. Under betændelse kan overdreven migration af aktiverede leukocytter over det vaskulære endotel til nøgleorganer føre til organsvigt. Et fysiologisk relevant biomimetisk mikrofluidisk assay (bMFA) er blevet udviklet og valideret ved hjælp af flere eksperimentelle og beregningsmæssige teknikker, som kan reproducere hele leukocytvalsnings-/vedhæftnings-/migrationskaskaden for at studere leukocyt-endotelcelleinteraktioner. Mikrovaskulære netværk opnået fra in vivo-billeder hos gnavere blev digitaliseret ved hjælp af en Geografisk Information System (GIS) tilgang og mikrofabrikeret med polydimethylsiloxan (PDMS) på et mikroskop dias. For at studere effekten af forskydningshastighed og vaskulær topologi på leukocyt-endotelcelleinteraktioner blev der udviklet en CFD-model (Computational Fluid Dynamics) for at generere et tilsvarende kort over forskydningshastigheder og hastigheder i hele netværket. BMFA muliggør kvantificering af leukocyt-endotelcelleinteraktioner, herunder rullehastighed, antal klæbede leukocytter som reaktion på forskellige forskydningshastigheder, antal migrerede leukocytter, endotelcellepermeabilitet, adhæsionsmolekyleekspression og andre vigtige variabler. Ved at anvende humanrelaterede prøver, såsom humane endotelceller og leukocytter, giver bMFA desuden et værktøj til hurtig screening af potentielle terapier for at øge deres kliniske oversættelighed.
Inflammation er værtsresponset på infektion og skade, og endotelet spiller en vigtig rolle i det inflammatoriske respons 1,2,3. Inflammatorisk dysregulering er den underliggende årsag til en række sygdomspatologier som sepsis, hjerte-kar-sygdomme, astma, inflammatorisk tarmsygdom, kræft og COVID-19. Leukocyt-endotelcelleinteraktioner spiller en central rolle i disse inflammatoriske sygdomme. Under inflammation aktiverer frigivelsen af PAMPS (patogen-associerede molekylære mønstre) fra patogener eller DAMPS (skadesrelaterede molekylære mønstre) fra skadede væv immunceller til at frigive cytokiner / kemokiner og andre proinflammatoriske mediatorer, der fører til aktivering af endotel, hvilket resulterer i ændringer i vaskulær endotelbarrierefunktion og øget permeabilitet 3,4 . Øget aktivering af endotelceller under inflammation resulterer i forbedret leukocyt-endotelcelleinteraktion, der fører til overdreven migration af aktiverede leukocytter over det vaskulære endotel til nøgleorganer 1,5,6,7.
Rekrutteringen af leukocytter initieres af kemisk forskelligartede kemotiltrækkende stoffer sammensat af bioaktive lipider, cytokiner, kemokiner og komplementkomponenter 8,9. Leukocytrekruttering er en flertrinsproces, der omfatter fem diskrete trin: 1) leukocytmargen og indfangning/fastgørelse, 2) rulning, 3) fast anholdelse, 4) spredning og gennemsøgning og 5) ekstravasation/migration (figur 1). Hvert trin i denne proces kræver krydstale mellem leukocytter og endotelceller for at orkestrere dette dynamiske fænomen 1,9. I sidste ende ekstravaserer arresterede leukocytter til betændte væv på tværs af endotel via en flertrinsproces styret af samtidige kemotiltrækkende signaler, klæbende hændelser og hæmodynamiske forskydningskræfter 1,9,10,11,12.
I betragtning af den centrale rolle, som forskydningsstress spiller i reguleringen af endotelcellefunktionen og betydningen af leukocyt-endotelcelleinteraktionerne13, er der i løbet af de sidste par årtier udviklet flere in vitro-modeller for at studere forskellige aspekter af leukocytmigrationskaskaden i et mere kontrolleret miljø14. Traditionelle fluidiske anordninger til undersøgelse af leukocyt-endotelcelleinteraktioner kan klassificeres i to brede kategorier14: a) anordninger til undersøgelse af leukocytvalsning, vedhæftning og adhæsionsmolekyleekspression såsom parallelle pladestrømningskamre og b) anordninger til undersøgelse af leukocytmigration under statiske forhold såsom transwellkamre. Systemer som parallelle pladestrømningskamre er blevet brugt til at studere adhæsionsmolekylernes og deres liganders roller i vedhæftningskaskaden under forskydningskræfter15. En væsentlig ulempe er imidlertid, at disse forenklede, idealiserede enheder (f.eks. Lige kanal) ikke er i stand til at reproducere skalaen og geometrien af in vivo-mikrovaskulaturen (f.eks. Successive vaskulære bifurkationer, vaskulær morfologi) og de resulterende strømningsbetingelser (f.eks. Konvergerende eller divergerende strømme ved bifurkationer). Som følge heraf kan disse enheder kun modellere vedhæftning, men ikke transmigration. Transwellkamre kan kun studere transmigration under statiske forhold uden at tage hensyn til in vivo geometriske træk og strømningsbetingelser. Således efterligner disse traditionelle modeller ikke mikromiljø af levende væv eller løser vedhæftnings- og migrationskaskade i et enkelt assay6.
For at imødegå denne begrænsning har vi udviklet og omfattende valideret et nyt 3D-biomimetisk mikrofluidisk assay (bMFA) (figur 2), som realistisk gengiver in vivo-mikrovaskulære netværk på en chip 16,17,18. Protokollen til mikrofabrikation af denne enhed er blevet offentliggjort tidligere17 og er kun kort beskrevet her. Mikrovaskulaturen af musens cremastermuskel blev digitaliseret ved hjælp af en modificeret Geografisk Information System (GIS) tilgang19. Derefter blev det syntetiske mikrovaskulære netværk genereret på polydimethylsiloxan (PDMS) ved hjælp af bløde litografiprocesser baseret på det digitaliserede mikrovaskulære netværk 14,17,20,21,22. Kort fortalt blev de digitaliserede netværksbilleder trykt på Mylar-film, som derefter blev brugt som en maske til at mønstre en SU-8 positiv fotoresist oven på en siliciumskive for at skabe mestrene til fremstilling. Mikrofabrikerede søjler (10 μm diameter, 3 μm høje) blev brugt til at skabe de 3 μm høje og 100 μm brede porer, en optimal størrelse til leukocytmigration 23,24,25, der forbinder de vaskulære kanaler og vævsrum. PDMS blev udarbejdet i henhold til producentens anvisninger og hældt over de udviklede mestre. Endvidere blev PDMS afgasset og fik lov til at hærde natten over i en ovn (65 °C) for at skabe komplementære mikrokanaler i PDMS. Efterfølgende blev den hærdede PDMS skrællet fra SU-8 masteren, efterfulgt af stanseporte til indløb/udløb. Derefter blev PMDS plasmabundet til et glasglas. Overfladen af den mikrofluidiske enhed består af indbygget glas og PDMS. For at fremme cellefastgørelse, spredning og spredning kræves ekstracelluar matrix (ECM) belægning. bMFA omfatter et mikrovaskulært netværk og et vævsrum forbundet via 3 μm høje og 100 μm brede porer (figur 2). Dette mikrofluidiske system reproducerer hele leukocytadhæsions-/migrationskaskaden i et fysiologisk relevant 3D-miljø i et komplet mikrovaskulært netværk med sammenkoblede beholdere og bifurkationer, herunder cirkulation, margen, rullning, vedhæftning og migration af leukocytter til det ekstravaskulære vævsrum i et enkelt system 14,16,17,21,26.
Det skal bemærkes, at selv når strømningshastigheden ved bMFA’s indløb er fast, varierer strømningsbetingelserne i netværket på forskellige steder og kan ikke beregnes ved hjælp af en simpel matematisk formel. En CFD-baseret model (Computational Fluid Dynamics) blev udviklet til at beregne forskellige flowparametre (f.eks. Forskydningsspænding, forskydningshastighed, hastighed) forskellige steder i netværket. Denne CFD-model blev brugt til at simulere farvestofperfusionsmønstre og flowparametre i bMFA. Krydsvalidering med eksperimentelle resultater antydede, at strømningsmodstandene på tværs af netværket er godt forudsagt af beregningsmodellen (figur 3)17. Denne CFD-model blev derefter brugt til at estimere hastighed og forskydningshastighedsprofil i hver beholder af bMFA (figur 4), hvilket ifølge analysen af virkningerne af forskydningsstrøm og geometri på leukocytvalsning, vedhæftning og migration16. Leukocytter klæber fortrinsvis nær bifurkationer og i områder med lav forskydning in vivo, og disse rumlige mønstre af leukocytadhæsion blev med succes demonstreret i bMFA ved anvendelse af neutrofiler (figur 5)16. Dette papir beskriver protokollen til fremstilling af bMFA til undersøgelse af leukocyt-endotelcelleinteraktion under inflammatoriske tilstande ved anvendelse af humane lungemikrovaskulære endotelceller (HLMVEC) og humane neutrofiler. Mikrofysiologiske systemer, såsom bMFA, kan bruges til at studere endotelcelleinteraktioner med forskellige typer celler såsom neutrofiler, monocytter, lymfocytter og tumorceller 18,27,28,29,30. BMFA kan podes med primære endotelceller fra forskellige organer (f.eks. Lunge vs. Hjerne) og forskellige arter (f.eks. Human vs. Murine endotelceller) samt endotelcellelinjer 21,27,31,32. bMFA kan bruges til at studere flere cellulære reaktioner, celle-celleinteraktioner, barrierefunktion, lægemiddellevering og lægemiddeltoksicitet.
bMFA reproducerer topografi og strømningsbetingelser i in vivo-mikrovaskulære netværk og kan bruges til at studere leukocyt-endotelcelleinteraktion og endotelfunktion in vitro under fysiologisk realistiske forhold. I mikrovaskulaturen hos enten mus eller menneske er geometrien i de mikrovaskulære netværk selvlignende og fraktale, og Reynolds-tallet << 1, hvilket indikerer, at vaskulær geometri ikke påvirker strømningsmønstre signifikant. Derfor kan bFMA bruges til at studere leukocyt-endotelint…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health, Grant Number: GM114359 og GM134701 (M.F.K. og L.E.K.), 1F31AI164870-01 (J.C.L.) og Defense Threat Reduction Agency, Grant Number: HDTRA11910012 (M.F.K. og L.E.K.).
1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
Biomimetic microfluidic assay (bMFA) | SynVivo | SMN1-C001 | Exclusive at SynVivo |
Blunt needle | Jensen Global | JG24-0.5 | |
Calcium Chloride | Fisher Scientific | C70-500 | |
CFDA, SE | ThermoFisher | C1157 | |
Dextran, 250,000, Powder | Spectrum Chemical Mfg. Corp | DE-130 | |
Ficoll-Paque Premium | GE Health Care | 17-5442-02 | Leukocyte isolation media |
fMLP | Sigma-Aldrich | F3506 | |
Hepes | Fisher Scientific | AAJ1692630 | |
Human fibronectin | Fisher Scientific | 33-016-015 | use vendor recommended ECM for different cell lines |
Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | cc-3202 | Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC). |
Human lung microvascular endothelial cells | Lonza | cc-2527 | use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS |
Magnesium Chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments Inc. | Microscope | |
NIS-elements, 5.20.01 | Nikon Instruments Inc. | Imaging software | |
PBS | Fisher Scientific | MT21040CV | |
PhD Ultra Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-3007 | Syringe Pump |
Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 02-003-763 | |
Recombinant Human TNF-alpha | R&D Systems | 210-TA | |
Slide clamp | SynVivo | ||
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S640-500 | |
Synvivo Pneumatic Primer | SynVivo | ||
Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS) | Lonza | cc-5034 | |
Tygon tubing | Fisher Scientific | 50-206-8921 | Tubing |