In dit protocol wordt een biomimetische microfluïde assay, die een fysiologisch relevante microvasculaire omgeving kan reproduceren en de gehele leukocytenadhesie / migratiecascade kan reproduceren, gebruikt om leukocyten-endotheelcelinteracties bij ontstekingsziekten te bestuderen.
Leukocyten-endotheelcelinteracties spelen een belangrijke rol bij ontstekingsziekten zoals sepsis. Tijdens ontsteking kan overmatige migratie van geactiveerde leukocyten over het vasculaire endotheel naar belangrijke organen leiden tot orgaanfalen. Een fysiologisch relevante biomimetische microfluïdische assay (bMFA) is ontwikkeld en gevalideerd met behulp van verschillende experimentele en computationele technieken, die de volledige leukocyten rollende / adhesie / migratiecascade kunnen reproduceren om leukocyten-endotheelcelinteracties te bestuderen. Microvasculaire netwerken verkregen uit in vivo beelden bij knaagdieren werden gedigitaliseerd met behulp van een Geografisch Informatie Systeem (GIS) benadering en gemicrofabriceerd met polydimethylsiloxaan (PDMS) op een microscoopglaasje. Om het effect van afschuifsnelheid en vasculaire topologie op leukocyten-endotheelcelinteracties te bestuderen, werd een Computational Fluid Dynamics (CFD) -model ontwikkeld om een overeenkomstige kaart van afschuifsnelheden en -snelheden in het hele netwerk te genereren. De bMFA maakt de kwantificering van leukocyten-endotheelcelinteracties mogelijk, waaronder rolsnelheid, aantal geconh adhered leukocyten in reactie op verschillende afschuifsnelheden, aantal gemigreerde leukocyten, endotheelceldoorlaatbaarheid, adhesiemolecuulexpressie en andere belangrijke variabelen. Bovendien biedt bMFA, door gebruik te maken van mensgerelateerde monsters, zoals menselijke endotheelcellen en leukocyten, een hulpmiddel voor snelle screening van potentiële therapieën om hun klinische vertaalbaarheid te vergroten.
Ontsteking is de reactie van de gastheer op infectie en letsel, en het endotheel speelt een belangrijke rol in de ontstekingsreactie 1,2,3. Inflammatoire ontregeling is de onderliggende oorzaak van een aantal ziektepathologieën zoals sepsis, hart- en vaatziekten, astma, inflammatoire darmaandoeningen, kanker en COVID-19. Leukocyten-endotheelcelinteracties spelen een centrale rol bij deze ontstekingsziekten. Tijdens ontsteking activeert de afgifte van PAMPS (pathogen-associated molecular patterns) uit pathogenen of DAMPS (damage-associated molecular patterns) uit gewonde weefsels immuuncellen om cytokines/chemokines en andere pro-inflammatoire mediatoren vrij te maken die leiden tot de activering van endotheel, resulterend in veranderingen in de vasculaire endotheelbarrièrefunctie en verhoogde permeabiliteit 3,4 . Verhoogde activering van endotheelcellen tijdens ontsteking resulteert in verbeterde interactie tussen leukocyten en endotheelcellen, wat leidt tot overmatige migratie van geactiveerde leukocyten over het vasculaire endotheel naar sleutelorganen 1,5,6,7.
De rekrutering van leukocyten wordt geïnitieerd door chemisch diverse chemoattractanten bestaande uit bioactieve lipiden, cytokines, chemokines en complementcomponenten 8,9. Leukocytenrekrutering is een proces in meerdere stappen dat vijf afzonderlijke stappen omvat: 1) leukocytenmargeatie en vangst/ hechting, 2) rollen, 3) stevige arrestatie, 4) spreiden en kruipen en 5) extravasatie / migratie (figuur 1). Elke stap van dit proces vereist overspraak tussen leukocyten en endotheelcellen om dit dynamische fenomeen te orkestreren 1,9. Uiteindelijk extravaseren gestileerde leukocyten naar ontstoken weefsels over endotheel via een meerstapsproces dat wordt gecontroleerd door gelijktijdige chemoattractant-afhankelijke signalen, kleefgebeurtenissen en hemodynamische schuifkrachten 1,9,10,11,12.
Gezien de centrale rol van schuifstress bij het reguleren van de endotheelcelfunctie en de betekenis van de leukocyten-endotheelcelinteracties13, zijn er de afgelopen decennia verschillende in vitro modellen ontwikkeld om verschillende aspecten van de leukocytenmigratiecascade in een meer gecontroleerde omgeving te bestuderen14. Traditionele fluidische apparaten om leukocyten-endotheelcelinteracties te bestuderen, kunnen worden ingedeeld in twee brede categorieën14: a) apparaten voor het bestuderen van leukocytenrollen, adhesie en adhesiemolecuulexpressie zoals parallelle plaatstroomkamers en b) apparaten voor het bestuderen van leukocytenmigratie onder statische omstandigheden zoals transwellkamers. Systemen zoals parallelle plaatstroomkamers zijn gebruikt om de rol van adhesiemoleculen en hun liganden in de adhesiecascade onder schuifkrachten15 te bestuderen. Een belangrijk nadeel is echter dat deze simplistische, geïdealiseerde apparaten (bijv. Recht kanaal) niet in staat zijn om de schaal en geometrie van de in vivo microvasculatuur (bijv. Opeenvolgende vasculaire bifurcaties, vasculaire morfologie) en de resulterende stroomomstandigheden (bijv. Convergerende of divergerende stromen bij bifurcaties) te reproduceren. Als gevolg hiervan kunnen deze apparaten alleen adhesie modelleren, maar geen transmigratie. Transwellkamers kunnen transmigratie alleen onder statische omstandigheden bestuderen zonder rekening te houden met de in vivo geometrische kenmerken en stromingsomstandigheden. Deze traditionele modellen bootsen dus niet de micro-omgeving van levende weefsels na of lossen adhesie- en migratiecascade op in een enkele test6.
Om deze beperking aan te pakken, hebben we een nieuwe 3D-biomimetische microfluïdische assay (bMFA) ontwikkeld en uitgebreid gevalideerd (figuur 2), die realistisch in vivo microvasculaire netwerken reproduceert op een chip 16,17,18. Het protocol voor microfabricage van dit apparaat is eerdergepubliceerd 17 en wordt hier slechts kort beschreven. De microvasculatuur van muis cremaster spier werd gedigitaliseerd met behulp van een gemodificeerd Geografisch Informatie Systeem (GIS) benadering19. Vervolgens werd het synthetische microvasculaire netwerk gegenereerd op polydimethylsiloxaan (PDMS) met behulp van softlithografieprocessen op basis van het gedigitaliseerde microvasculaire netwerk 14,17,20,21,22. Kortom, de gedigitaliseerde netwerkbeelden werden afgedrukt op Mylar-film, die vervolgens werd gebruikt als een masker om een SU-8 positieve fotoresist bovenop een siliciumwafer te patroon om de meesters voor fabricage te maken. Microfabricated pilaren (10 μm diameter, 3 μm hoog) werden gebruikt om de 3 μm hoge en 100 μm brede poriën te creëren, een optimale grootte voor leukocytenmigratie 23,24,25, die de vasculaire kanalen en weefselcompartimenten met elkaar verbinden. PDMS werd bereid volgens de instructies van de fabrikant en over de ontwikkelde meesters gegoten. Verder werd het PDMS ontgast en een nacht in een oven (65 °C) uitharden om complementaire microkanalen in PDMS te creëren. Vervolgens werd het uitgeharde PDMS van de SU-8 master geschild, gevolgd door ponspoorten voor inlaten/uitgangen. Vervolgens werd de PMDS plasma gebonden aan een glasplaat. Het oppervlak van het microfluïdische apparaat bestaat uit native glas en PDMS. Om celaanhechting, verspreiding en proliferatie te bevorderen, is extracelluar matrix (ECM) coating vereist. De bMFA omvat een microvasculair netwerk en een weefselcompartiment verbonden via 3 μm hoge en 100 μm brede poriën (figuur 2). Dit microfluïdische systeem reproduceert de volledige leukocytenadhesie/migratiecascade in een fysiologisch relevante 3D-omgeving van een compleet microvasculair netwerk met onderling verbonden vaten en bifurcaties, inclusief circulatie, marginatie, rollen, adhesie en migratie van leukocyten naar het extra vasculaire weefselcompartiment in een enkel systeem 14,16,17,21,26.
Opgemerkt moet worden dat zelfs wanneer het debiet bij de inlaat van bMFA vaststaat, de stroomomstandigheden in het netwerk op verschillende locaties variëren en niet kunnen worden berekend met een eenvoudige wiskundige formule. Een op COMPUTATIONAL FLUID DYNAMICS (CFD) gebaseerd model werd ontwikkeld om verschillende stroomparameters (bijv. Schuifspanning, afschuifsnelheid, snelheid) op verschillende locaties in het netwerk te berekenen. Dit CFD-model werd gebruikt om de kleurstofperfusiepatronen en stromingsparameters in de bMFA te simuleren. Kruisvalidatie met experimentele resultaten suggereerde dat de stroomweerstanden over het netwerk goed worden voorspeld door het computationele model (figuur 3)17. Dit CFD-model werd vervolgens gebruikt om de snelheid en het afschuifsnelheidsprofiel in elk vat van bMFA te schatten (figuur 4), waardoor de effecten van afschuifstroom en geometrie op leukocytenrollen, adhesie en migratiekonden worden geanalyseerd 16. Leukocyten hechten zich bij voorkeur in de buurt van bifurcaties en in lage schuifgebieden in vivo, en deze ruimtelijke patronen van leukocytenadhesie werden met succes aangetoond in bMFA met behulp van neutrofielen (figuur 5)16. Dit artikel beschrijft het protocol voor het voorbereiden van bMFA om leukocyten-endotheelcelinteractie onder inflammatoire omstandigheden te bestuderen met behulp van menselijke longmicrovasculaire endotheelcellen (HLMVEC) en menselijke neutrofielen. Microfysiologische systemen, zoals de bMFA, kunnen worden gebruikt om endotheelcelinteracties te bestuderen met verschillende soorten cellen zoals neutrofielen, monocyten, lymfocyten en tumorcellen 18,27,28,29,30. De bMFA kan worden bezaaid met primaire endotheelcellen uit verschillende organen (bijv. Long versus hersenen) en verschillende soorten (bijv. Menselijke versus muriene endotheelcellen), evenals endotheelcellijnen 21,27,31,32. De bMFA kan worden gebruikt om meerdere cellulaire responsen, cel-cel interacties, barrièrefunctie, medicijnafgifte en geneesmiddeltoxiciteit te bestuderen.
De bMFA reproduceert de topografie en stromingscondities van de in vivo microvasculaire netwerken en kan worden gebruikt om leukocyten-endotheelcelinteractie en endotheelfunctie in vitro te bestuderen onder fysiologisch realistische omstandigheden. In de microvasculatuur van muis of mens is de geometrie van de microvasculaire netwerken zelfgelijkaardig en fractaal, en het Reynolds-getal << 1, wat aangeeft dat vasculaire geometrie geen significante invloed heeft op stromingspatronen. Daarom kan de bFMA w…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health, Grant Number: GM114359 en GM134701 (M.F.K. en L.E.K.), 1F31AI164870-01 (J.C.L.), en Defense Threat Reduction Agency, Grant Number: HDTRA11910012 (M.F.K. en L.E.K.).
1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
Biomimetic microfluidic assay (bMFA) | SynVivo | SMN1-C001 | Exclusive at SynVivo |
Blunt needle | Jensen Global | JG24-0.5 | |
Calcium Chloride | Fisher Scientific | C70-500 | |
CFDA, SE | ThermoFisher | C1157 | |
Dextran, 250,000, Powder | Spectrum Chemical Mfg. Corp | DE-130 | |
Ficoll-Paque Premium | GE Health Care | 17-5442-02 | Leukocyte isolation media |
fMLP | Sigma-Aldrich | F3506 | |
Hepes | Fisher Scientific | AAJ1692630 | |
Human fibronectin | Fisher Scientific | 33-016-015 | use vendor recommended ECM for different cell lines |
Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | cc-3202 | Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC). |
Human lung microvascular endothelial cells | Lonza | cc-2527 | use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS |
Magnesium Chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments Inc. | Microscope | |
NIS-elements, 5.20.01 | Nikon Instruments Inc. | Imaging software | |
PBS | Fisher Scientific | MT21040CV | |
PhD Ultra Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-3007 | Syringe Pump |
Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 02-003-763 | |
Recombinant Human TNF-alpha | R&D Systems | 210-TA | |
Slide clamp | SynVivo | ||
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S640-500 | |
Synvivo Pneumatic Primer | SynVivo | ||
Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS) | Lonza | cc-5034 | |
Tygon tubing | Fisher Scientific | 50-206-8921 | Tubing |