Visualizando mudanças no Circuito Neuron-Glia com a Técnica de Imagem de Cálcio
Summary
A imagem celular de cálcio é uma metodologia versátil para estudar a sinalização dinâmica de células individuais, em populações mistas na cultura ou mesmo em animais despertados, com base na expressão de canais/receptores permeáveis de cálcio que dão assinaturas funcionais únicas.
Abstract
Aqui, relatamos modelos in vitro seletivos de circuitos baseados em glia (astrócitos, oligodendrócitos e microglia) e/ou neurônios de tecidos periféricos (gânglios raiz dorsal) e centrais (córtex, zona subventricular, organoide) que são estudados dinamicamente em termos de mudanças de cálcio. O modelo escolhido para ilustrar os resultados é a retina, um tecido simples com interações celulares complexas. O cálcio é um mensageiro universal envolvido na maioria dos papéis celulares importantes. Explicamos em um protocolo passo-a-passo como as células neuron-glial da retina na cultura podem ser preparadas e avaliadas, imaginando mudanças de cálcio. Neste modelo, diferenciamos neurônios da glia com base em sua resposta seletiva ao KCl e ATP. Receptores e canais permeáveis de cálcio são expressos seletivamente em diferentes compartimentos. Para analisar as respostas de cálcio, usamos mortes fluorescentes racionmétricas como fura-2. Esta sonda quantifica a concentração gratuita de Ca2+ com base em formas ligadas a Ca2+e Ca2+, apresentando dois picos diferentes, fundadas na intensidade de fluorescência percebida em dois comprimentos de onda.
Introduction
Devido às propriedades universais do cálcio como segundo mensageiro, este íon está envolvido em um grande número de atividades de sinalização: transcrição genética, nascimento e morte, proliferação, migração e diferenciação, transmissão sináptica e plasticidade. Assim, um método capaz de rastrear a dinâmica de ativação de cálcio com fidelidade e agilidade forneceria uma maneira de observar respostas espaciais-temporais únicas. Tal método é a técnica de imagem de cálcio celular, que correlaciona dados funcionais de cálcio com fenótipos celulares específicos com base em suas respostas distintas.
As sondas Ca2+ foram desenvolvidas pela primeira vez na década de 1980, com melhorias posteriores permitindo que essas moléculas fossem usadas em ensaios de células vivas1. Como indicador químico, a Fura-2 é considerada o padrão para medições quantitativas [Ca2+]i. O éster de acetoximilo (AM) deste indicador (ou seja, Fura-2 AM) permeia facilmente a membrana celular e pode atingir concentrações intracelulares 20 vezes maiores que a diluição de incubação (por exemplo, [5 μM]o/[100 μM]i). Outra vantagem da Fura-2 é que ele tem boa resistência fotobleaching; assim, a imagem deste indicador por períodos mais longos de tempo não afetará muito suas capacidades de fluorescência. Finalmente, a Fura-2 é sensível a uma ampla gama de níveis de cálcio, de ~100 nM a ~100 μM, e tem um Kd de ~145 nM, que é comparável ao repouso [Ca2+]i2. Posteriormente, a imagem de cálcio celular foi desenvolvida com melhores microscópios fluorescentes e métodos de computação, juntamente com sondas racionmétricas que não são afetadas pelo carregamento de corantes.
Cada célula expressa diferentes dispositivos de cálcio (bombas, transportadores, receptores e canais) que contribuem para a resposta final como uma assinatura particular. A dica importante é encontrar respostas seletivas de diferentes tipos de células correlacionadas com sua expressão fenotípica. Assim, existem pelo menos dois receptores diferentes que operam através de mudanças de cálcio: receptores ionotróricos que permeiam o Ca2+ em um modo rápido e receptores metabotrópicos lentos acoplados a vias de sinalização e estoques intracelulares que liberam Ca2+ ativados por terceiros, como triphosfato inositol e ADP-ribose3 cíclico.
Por exemplo, as células progenitoras expressam nestin na retina imatura e mostram receptores GABAA despolarizados por GABA (ou muscimol)4. Isso acontece devido ao gradiente cl-eletroquímico com altos níveis de Cl intracelular; à medida que o tecido se desenvolve, os transportadores KCC2 mudam de excitação em progenitores para inibição em neurônios GABAérgicos maduros5. Por outro lado, células-tronco que expressam sox-2 na imatura zona subventricular (SVZ) de roedores pós-natais também apresentam receptores metabotrópicos H1 ativados pela histamina aumentando Ca2+ de forma lenta6. Um segundo receptor metabotrópico da família receptor-1 (PAR-1) ativado por trombina e rio abaixo para G (q/11) e fosfolipase C (PLC), dá mudanças lentas de Ca2+ em oligodendrocytes (que expressam O4 e PLP) gerados a partir de células-tronco neurais SVZ multipotentes7.
Em geral, os neurônios expressam canais de cálcio dependentes de tensão, bem como os principais receptores neurotransmissores permeáveis ao Ca2+, como glutamatergicos (AMPA, NMDA, kainate) e receptores nicotínicos periféricos e centrais. Cloreto de potássio é geralmente usado como um agente despolarizador para ativar neurônios periféricos, como os neurônios gânglios raiz dorsal8 ou neurônios centrais, a partir de zona subventricular9 ou retina10. Por outro lado, a ATP é reconhecida como o principal gliotransmissor (além do D-serine), que ativa membros P2X permeáveis seletivos Ca2+, como P2X7 e P2X4. Ambos os receptores apresentam correntes ca2+equivalentes, semelhantes às mostradas pelos receptores NMDA reconhecidas como as maiores correntes Ca2+ ativadas pelos transmissores11. Os receptores P2X7 são altamente expressos em microglia, mas em uma densidade menor em astrócitos e oligodendrócitos, tendo um papel na liberação de citocinas proinflamatórias12. Os receptores P2X7 também são expressos nas células Schwann13 e Müller glia na retina14,15.
A retina é conhecida por mostrar quase todos os transmissores vistos no cérebro. Por exemplo, o eixo vertical (fotorreceptores, células gânglios bipolares e retina) é principalmente glutamatergicos, com receptores AMPA permeáveis de cálcio ou kainate expressos em células OFF-bipolar e mgluR6 expressos em células ON-bipolar16. Curiosamente, todos os três receptores também são encontrados em Müller glia, que são acoplado a caminhos triptosfato de cálcio e inositol17,18. O eixo inibitório horizontal, feito por células horizontais e amacrinas, secretam não apenas gaba, mas também dopamina, acetilcolina e outros neurotransmissores clássicos. As células amacrinas são os principais tipos de células encontradas nas culturas de retina aviária, mostrando vários tipos de canais operados por cálcio, como canais glutamatericos, purinérgicos, nicotinicos e de cálcio dependentes de tensão. Por essa razão, este é um excelente modelo para avaliar diferentes propriedades de mudanças de cálcio entre neurônios e glia.
Portanto, a combinação de diferentes receptores e canais resumidos a marcadores fenotípicos seletivos durante o desenvolvimento com padrões de resposta agonista distintos permite assinaturas únicas em haste, progenitor, neurônio, astrócito, oligodendrocyte e microglia que operam através de dispositivos de sinalização seletiva.
Protocol
Representative Results
Discussion
Usamos o tecido da retina para mostrar que as respostas de cálcio mediadas por KCl ou ATP são claramente compartimentadas em respostas neuronais e gliais, respectivamente (Figura 1). Embora alguns dados na literatura impliquem que os receptores P2X7 sejam expressos em neurônios, que regulam a atividade neuronal e a liberação de neurotransmissores sinápticos20, outros autores questionam a existência de receptores P2X7 neuronais. De fato, os resultados atuais sus…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bolsas, patrocinadores e fontes de financiamento: A MS é beneficiária de uma bolsa de doutorado do CNPq. A HRF é beneficiária de uma bolsa pós-doutorado apoiada pelo CNPq (número de bolsas do HRF 152071/2020-2). O RAMR conta com o apoio do CNPq e da FAPERJ (números de bolsas E-26/202.668/2018, E-26/010.002215/2019, 426342/2018-6 e 312157/2016-9 e INCT-INNT (Instituto Nacional de Neurociências Translacionais).
Materials
| 15 mm coverslip | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 111550 | Cell suport |
| 510 nm long-pass filter | Carl Zeiss | ||
| ATP | Sigma | A1852 | |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Suplement |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| CoolSNAP digital camera | Roper Scientific, Trenton, NJ | ||
| D-(+)-Glucose | Neon | 1466 | |
| DMEM/ F-12 | Gibco | 12400-24 | Cell culture medium |
| Excel Software | Microsoft | ||
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | Suplement |
| Fluorescence Microscope | Axiovert 200; Carl Zeiss | B 40-080 | |
| Fura-2 AM | Molecular Probes | F1221 | Ratiometric Ca2+ indicator |
| Gentamicin Sulfate | Calbiochem | 1405-41-0 | antibiotics |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Lambda DG-4 apparatus | Sutter Instrument, Novato, CA | DG-4PLUS/OF30 | |
| Laminin | Gibco | 23017-015 | Help cell adhesion |
| Metafluor software | Universal Imaging Corp. West Chester, PA | ||
| MgCl2 | Sigma | M4880 | |
| Na2HPO4 | Vetec | 129 | |
| NaCl | Isofar | 310 | |
| NaHCO3 | Vetec | 306 | |
| PH3 platform | Warner Intruments, Hamden, CT | 64-0286 | |
| Pluronic F-127 | Molecular Probes | P6866 | nonionic, surfactant |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | Help cell adhesion |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Gibco | 25200056 | Dissociation enzyme |
References
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