Modellierung neonataler intraventrikulärer Blutungen durch intraventrikuläre Injektion von Hämoglobin
Summary
Wir präsentieren ein Modell der neonatalen intraventrikulären Blutung mit Rattenwelpen, das die Pathologie beim Menschen nachahmt.
Abstract
Die intraventrikuläre Tumorblutung (IVH) ist eine häufige Folge einer Frühgeburt und führt zu Hirnverletzungen, poshämorrhagischem Hydrozephalus (PHH) und lebenslangen neurologischen Ausfällen. Während PHH durch temporäre und permanente Zerebrospinalflüssigkeit (Liquor) Diversionsverfahren (ventrikuläres Reservoir bzw. ventrikuloperitonealer Shunt) behandelt werden kann, gibt es keine pharmakologischen Strategien zur Vorbeugung oder Behandlung von IVH-induzierten Hirnverletzungen und Hydrocephalus. Tiermodelle werden benötigt, um die Pathophysiologie der IVH besser zu verstehen und pharmakologische Behandlungen zu testen. Während es existierende Modelle der neonatalen IVH gibt, sind diejenigen, die zuverlässig zu Hydrocephalus führen, oft durch die Notwendigkeit großvolumiger Injektionen eingeschränkt, was die Modellierung der Pathologie erschweren oder Variabilität im beobachteten klinischen Phänotyp einführen kann.
Neuere klinische Studien haben Hämoglobin und Ferritin mit der Verursachung einer ventrikulären Vergrößerung nach IVH in Verbindung gebracht. Hier entwickeln wir ein einfaches Tiermodell, das den klinischen Phänotyp von PHH nachahmt, indem wir kleinvolumige intraventrikuläre Injektionen des Blutabbauprodukts Hämoglobin verwenden. Neben der zuverlässigen Induktion von ventrikulärer Vergrößerung und Hydrozephalus führt dieses Modell zu Verletzungen der weißen Substanz, Entzündungen und Immunzellinfiltrationen in periventrikulären und weißen Substanzregionen. Dieser Artikel beschreibt diese klinisch relevante, einfache Methode zur Modellierung von IVH-PHH bei neonatalen Ratten mittels intraventrikulärer Injektion und stellt Methoden zur Quantifizierung der Ventrikelgröße nach der Injektion vor.
Introduction
Neugeborene IVH stammt aus der Keimmatrix, einem Ort der schnellen Zellteilung, der an die lateralen Ventrikel des sich entwickelnden Gehirns angrenzt. Diese stark vaskuläre Struktur ist anfällig für hämodynamische Instabilität im Zusammenhang mit Frühgeburten. Blut wird bei der Keimmatrixblutung (GMH)-IVH in die lateralen Ventrikel freigesetzt, wenn zerbrechliche Blutgefäße innerhalb der Keimmatrix reißen. Bei IVH Grad IV kann auch ein periventrikulärer hämorrhagischer Infarkt zur Freisetzung von Blutprodukten im Gehirn beitragen. 1 Die Kombination von GMH-IVH kann PHH verursachen, insbesondere nach hochgradigen Blutungen (Grad III und IV)1. PHH kann mit der Platzierung eines ventrikuloperitonealen Shunts behandelt werden, aber die Shunt-Platzierung macht die Hirnverletzung, die durch IVH auftreten kann, nicht rückgängig. Obwohl die moderne neonatale Intensivmedizin die IVH-Raten gesenkt hat2, 3, gibt es keine spezifischen Behandlungen für die Hirnverletzung oder den Hydrozephalus, die durch IVH verursacht werden, sobald sie aufgetreten ist. Eine signifikante Einschränkung bei der Entwicklung präventiver Behandlungen für IVH-induzierte Hirnverletzungen und PHH ist das unvollständige Verständnis der IVH-Pathophysiologie.
Kürzlich wurde gezeigt, dass frühe Liquorspiegel des wichtigsten Blutabbauprodukts Hämoglobin mit der späteren Entwicklung von PHH bei Neugeborenen mit hochgradigem IVH4 assoziiert sind. Darüber hinaus sind die Liquorspiegel von Eisen-Handling-Signalweg-Proteinen – Hämoglobin, Ferritin und Bilirubin – mit der Ventrikelgröße bei neonataler IVH assoziiert. Dies zeigte sich auch in einer multizentrischen Kohorte von Säuglingen mit vorzeitiger PHH, bei der höhere ventrikuläre Liquorspiegel von Ferritin mit einer größeren Ventrikelgröße5 assoziiert waren.
In dieser Studie entwickelten wir ein klinisch relevantes Modell für IVH-induzierte Hirnverletzungen und Hydrozephalus unter Verwendung von Hämoglobininjektion in die Hirnventrikel, was die Quantifizierung von Hirnverletzungen und PHH und das Testen neuer therapeutischer Strategien ermöglicht (Abbildung 1)6, 7. Dieses IVH-Modell verwendet neonatale Rattenwelpen, die für die Dauer des Eingriffs unter Vollnarkose gestellt werden. Ein Mittellinienschnitt wird auf der Kopfhaut gemacht, und Koordinaten, die von Schädellandmarken – dem Bregma oder Lambda – abgeleitet werden, werden verwendet, um die lateralen Ventrikel für die Injektion zu erreichen. Eine langsame Injektion mit einer Infusionspumpe liefert Hämoglobin in den Ventrikel. Dieses Protokoll ist einfach zu bedienen, vielseitig und kann verschiedene Komponenten von IVH modellieren, die zu PHH führen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses IVH-Modell, das Hämoglobininjektion verwendet, ermöglicht die Untersuchung der Pathologie von IVH, die spezifisch durch Hämoglobin vermittelt wird. Für ergänzende Studien kann Hämoglobin auch leicht in vitro verabreicht werden und verwirrt nicht biochemische Assays für Proteine, die von Mikroglia / Makrophagen hergestellt werden, die im Vollblut vorhanden sind.
Die führenden Theorien der IVH-PHH umfassen die mechanische Obstruktion der Liquorzirkulation, die Störung vo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JMS erhielt Mittel von NIH / NINDS R01 NS110793 und K12 (Neurosurgeon Research Career Development Program). BAM erhielt Mittel von NIH / NINDS K08 NS112580-01A1, University of Kentucky Neuroscience Research Priority Area Award und einen Hydrocephalus Association Innovator Award.
Materials
| 0.3 mL insulin syringe | BD Microfine + Insulin Syringe | 230-4533 | 0.3-0.5 mL synringes will work |
| 1.5 mL microtube | USA Scientific | 1615-5500 | Lot No. K194642H -3 511 |
| 4.7T MRI | Agilent/Varian | 4.7T/33 cm | Agilent/Varian DirectDrive 4.7-T (200-MHz) MRI system |
| 6-0 monofilament suture | ETHICON | 667G | |
| 9.4T MRI | Bruker | BioSpec 94/20 | Used in this protocol without the cryoprobe |
| Analytical balance | CCURIS Instruments | W3200-320 | |
| Artificial CSF (aCSF) | Tocris Bioscience | 3525 | Batch No: 72A |
| Betadine | Purdue Products L.P. | 301005-00 | NDC 67618-150-09 |
| Carprofen (injectable) | Zoetis Inc. | PI 4019448 | Rimadyl |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| Heating pad | Sunbeam | E12107-819 | UL 612A, Z-1228-001 |
| Hemoglobin | MP Biomedicals | 100714 | LOT NO. SR02321 |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Isoflurane vaporizer | VETEQUIP | 911103 | |
| Light for stereotactic insturment | Dolan-Jenner industries | Fiber-Lite MI-150 | |
| Microinjection syringe pump | World Precision Instruments | MICRO21 | Serial 184034 T08K |
| MRI software | Bruker BioSpin | Paravision 360 3.2 | |
| Oxygen | Airgas Healthcare | UN1072 | LOT NUMBER S1432080XA02 |
| Sprague Dawley rats | Charles River Laboratories | Strain code: 001 | |
| Stereotactic instrument | KOPF Instuments | Model 900LS Lazy Susan | |
| Sterile cotton tipped applicator | Fischerbrand | 23-400-118 | |
| Surgical blade | covetrus | #10 | |
| Topical triple antibiotic | Triple Antibiotic Ointment | NDC 51672-2120-1 | |
| Ventricle volume quantification software | ITK-SNAP | ITK-SNAP 4.0.0 beta |
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