Summary

Modelagem da Hemorragia Intraventricular Neonatal Através da Injeção Intraventricular de Hemoglobina

Published: August 25, 2022
doi:

Summary

Apresentamos um modelo de hemorragia intraventricular neonatal utilizando filhotes de ratos que mimetiza a patologia observada em humanos.

Abstract

A hemorragia intraventricular neonatal (IVH) é uma consequência comum do parto prematuro e leva a lesão cerebral, hidrocefalia pós-hemorrágica (HPH) e déficits neurológicos ao longo da vida. Embora a PHH possa ser tratada por procedimentos de desvio temporários e permanentes do líquido cefalorraquidiano (LCR) (reservatório ventricular e shunt ventriculoperitoneal, respectivamente), não há estratégias farmacológicas para prevenir ou tratar lesão cerebral induzida por IV e hidrocefalia. Modelos animais são necessários para entender melhor a fisiopatologia da IVH e testar tratamentos farmacológicos. Embora existam modelos existentes de HVI neonatal, aqueles que resultam de forma confiável em hidrocefalia são frequentemente limitados pela necessidade de injeções de grande volume, o que pode complicar a modelagem da patologia ou introduzir variabilidade no fenótipo clínico observado.

Estudos clínicos recentes implicaram hemoglobina e ferritina na causa de aumento ventricular após IVH. Aqui, desenvolvemos um modelo animal simples que imita o fenótipo clínico da PHH utilizando injeções intraventriculares de pequeno volume do produto de degradação do sangue hemoglobina. Além de induzir de forma confiável o aumento ventricular e a hidrocefalia, esse modelo resulta em lesão da substância branca, inflamação e infiltração de células imunes nas regiões periventricular e da substância branca. Este trabalho descreve este método clinicamente relevante e simples para modelar a HPH-IV em ratos neonatais usando injeção intraventricular e apresenta métodos para quantificar o tamanho do ventrículo após a injeção.

Introduction

A IVH neonatal origina-se da matriz germinativa, um local de rápida divisão celular adjacente aos ventrículos laterais do cérebro em desenvolvimento. Essa estrutura altamente vascular é vulnerável à instabilidade hemodinâmica relacionada ao parto prematuro. O sangue é liberado nos ventrículos laterais na hemorragia da matriz germinativa (GMH)-IVH quando os vasos sanguíneos frágeis dentro da matriz germinativa se rompem. No caso da IV IV de grau IV, o infarto hemorrágico periventricular também pode contribuir para a liberação de hemoderivados dentro do cérebro. 1 A combinação de GMH-IVH pode causar HPH, particularmente após hemorragia de alto grau (graus III e IV)1. A HPH pode ser tratada com a colocação de um shunt ventriculoperitoneal, mas a colocação do shunt não reverte a lesão cerebral que pode ocorrer a partir da IVH. Embora a terapia intensiva neonatal moderna tenha reduzido as taxas de IVH2, 3, não há tratamentos específicos para a lesão cerebral ou hidrocefalia causada pela IVH uma vez que tenha ocorrido. Uma limitação significativa no desenvolvimento de tratamentos preventivos para lesão cerebral induzida por HIV e HPH é a compreensão incompleta da fisiopatologia da HIV.

Recentemente, os níveis iniciais do LCR de hemoglobina de produto chave de degradação do sangue demonstraram estar associados ao desenvolvimento posterior de PHH em neonatos com IVH de alto grau4. Além disso, os níveis de proteínas da via de manipulação de ferro no LCR – hemoglobina, ferritina e bilirrubina – estão associados ao tamanho do ventrículo na IVH neonatal. Isso também foi demonstrado em uma coorte multicêntrica de lactentes com HPH pré-termo, onde níveis mais elevados de ferritina no LCR ventricular foram associados a um tamanho maior do ventrículo5.

Neste estudo, desenvolvemos um modelo clinicamente relevante de lesão cerebral induzida por IV e hidrocefalia utilizando injeção de hemoglobina nos ventrículos cerebrais, que permite quantificar a lesão cerebral e a HPH e testar novas estratégias terapêuticas (Figura 1)6, 7. Este modelo IVH utiliza filhotes de ratos neonatais, que são colocados sob anestesia geral durante o procedimento. Uma incisão na linha média é feita no couro cabeludo, e coordenadas derivadas de marcos do crânio – o bregma ou lambda – são usadas para atingir os ventrículos laterais para injeção. A injeção lenta usando uma bomba de infusão fornece hemoglobina no ventrículo. Este protocolo é fácil de usar, versátil e pode modelar diferentes componentes da IVH que resultam em PHH.

Protocol

NOTA: Todos os protocolos de animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais das instituições. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, reagentes, equipamentos e softwares usados neste protocolo. 1. Preparação de soluções de hemoglobina e LCR Preparar uma solução estéril de LCR artificial (aCSF) adicionando 500 μL da solução de aCSF a um microtubo de 1,5 ml e conservar em gelo. <l…

Representative Results

O sucesso da injeção foi confirmado por meios radiológicos e imuno-histoquímicos. Os animais submetidos à injeção de hemoglobina desenvolveram ventriculomegalia aguda moderada quando avaliados por RM (Figura 2A), com ventrículos laterais significativamente maiores às 24 h e 72 h após a injeção de hemoglobina em comparação aos animais injetados no LCR (Figura 2B,C). Embora não tenha havido diferença significativa no volume do vent…

Discussion

Este modelo de IVH utilizando injeção de hemoglobina permite o estudo da patologia da IVH especificamente mediada pela hemoglobina. Para estudos complementares, a hemoglobina também pode ser facilmente administrada in vitro e não confunde ensaios bioquímicos para proteínas produzidas por micróglias / macrófagos que estão presentes no sangue total.

As principais teorias da HIF-IV incluem a obstrução mecânica da circulação do LCR, a ruptura dos cílios que revestem as pare…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

O JMS recebeu financiamento do NIH/NINDS R01 NS110793 e K12 (Neurosurgeon Research Career Development Program). A BAM recebeu financiamento do NIH/NINDS K08 NS112580-01A1, Prêmio da Área Prioritária de Pesquisa em Neurociência da Universidade de Kentucky e um Prêmio Inovador da Associação de Hidrocefalia .

Materials

0.3 mL insulin syringe BD Microfine + Insulin Syringe 230-4533 0.3-0.5 mL synringes will work
1.5 mL microtube USA Scientific 1615-5500 Lot No. K194642H -3 511
4.7T MRI Agilent/Varian 4.7T/33 cm Agilent/Varian DirectDrive 4.7-T (200-MHz) MRI system
6-0 monofilament suture ETHICON 667G
9.4T MRI Bruker BioSpec 94/20 Used in this protocol without the cryoprobe
Analytical balance CCURIS Instruments W3200-320
Artificial CSF (aCSF) Tocris Bioscience 3525 Batch No: 72A
Betadine Purdue Products L.P. 301005-00 NDC 67618-150-09
Carprofen (injectable) Zoetis Inc.  PI 4019448 Rimadyl
Ethanol Decon Laboratories 2701
Heating pad Sunbeam E12107-819 UL 612A, Z-1228-001
Hemoglobin MP Biomedicals 100714 LOT NO. SR02321
Isoflurane Piramal Critical Care NDC 66794-017-25
Isoflurane vaporizer VETEQUIP 911103
Light for stereotactic insturment Dolan-Jenner industries Fiber-Lite MI-150
Microinjection syringe pump World Precision Instruments MICRO21 Serial 184034 T08K
MRI software Bruker BioSpin Paravision 360 3.2
Oxygen Airgas Healthcare UN1072 LOT NUMBER S1432080XA02
Sprague Dawley rats Charles River Laboratories Strain code: 001
Stereotactic instrument KOPF Instuments Model 900LS Lazy Susan
Sterile cotton tipped applicator Fischerbrand 23-400-118
Surgical blade covetrus #10
Topical triple antibiotic Triple Antibiotic Ointment NDC 51672-2120-1
Ventricle volume quantification software ITK-SNAP ITK-SNAP 4.0.0 beta

References

  1. Robinson, S. Neonatal posthemorrhagic hydrocephalus from prematurity: Pathophysiology and current treatment concepts: A review. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 9 (3), (2012).
  2. Hasselager, A. B., Børch, K., Pryds, O. A. Improvement in perinatal care for extremely premature infants in Denmark from. Danish Medical Journal. 63 (1), (1994).
  3. Johnston, P. G., Gillam-Krakauer, M., Fuller, M. P., Reese, J. Evidence-Based Use of Indomethacin and Ibuprofen in the Neonatal Intensive Care Unit. Clinics in Perinatology. 39 (1), (2012).
  4. Mahaney, K. B., Buddhala, C., Paturu, M., Morales, D., Limbrick, D. D., Strahle, J. M. Intraventricular Hemorrhage Clearance in Human Neonatal Cerebrospinal Fluid: Associations with Hydrocephalus. Stroke. , (2020).
  5. Strahle, J. M., et al. Longitudinal CSF Iron Pathway Proteins in Posthemorrhagic Hydrocephalus: Associations with Ventricle Size and Neurodevelopmental Outcomes. Annals of Neurology. 90 (2), (2021).
  6. Strahle, J. M., et al. Role of Hemoglobin and Iron in hydrocephalus after neonatal intraventricular hemorrhage. Neurosurgery. 75 (6), (2014).
  7. Garton, T. P., He, Y., Garton, H. J. L., Keep, R. F., Xi, G., Strahle, J. M. Hemoglobin-induced neuronal degeneration in the hippocampus after neonatal intraventricular hemorrhage. Brain Research. 1635, (2016).
  8. Goulding, D. S., Caleb Vogel, ., Gensel, R., Morganti, J. C., Stromberg, J. M., Miller, A. J., A, B. Acute brain inflammation, white matter oxidative stress, and myelin deficiency in a model of neonatal intraventricular hemorrhage. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 26 (6), (2020).
  9. Strahle, J., Garton, H. J. L., Maher, C. O., Muraszko, K. M., Keep, R. F., Xi, G. Mechanisms of Hydrocephalus After Neonatal and Adult Intraventricular Hemorrhage. Translational Stroke Research. 3, (2012).
  10. Jinnai, M., et al. A Model of Germinal Matrix Hemorrhage in Preterm Rat Pups. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, (2020).
  11. Georgiadis, P., et al. Characterization of acute brain injuries and neurobehavioral profiles in a rabbit model of germinal matrix hemorrhage. Stroke. 39 (12), (2008).
  12. Cherian, S. S., Love, S., Silver, I. A., Porter, H. J., Whitelaw, A. G. L., Thoresen, M. Posthemorrhagic ventricular dilation in the neonate: Development and characterization of a rat model. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 62 (3), (2003).
  13. Balasubramaniam, J., Xue, M., Buist, R. J., Ivanco, T. L., Natuik, S., del Bigio, ., R, M. Persistent motor deficit following infusion of autologous blood into the periventricular region of neonatal rats. Experimental Neurology. (1), (2006).
  14. Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances. The Lancet Neurology. 8 (1), (2009).
  15. Dobbing, J., Sands, J. Comparative aspects of the brain growth spurt. Early Human Development. 3 (1), (1979).
  16. Craig, A., et al. Quantitative analysis of perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Experimental Neurology. 181 (2), (2003).
  17. Lodygensky, G. A., Vasung, L., Sv Sizonenko, ., Hüppi, P. S. Neuroimaging of cortical development and brain connectivity in human newborns and animal models. Journal of Anatomy. 217 (4), (2010).
  18. Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Developmental Neuroscience. 33 (34), (2011).
  19. Engelhardt, B. Development of the blood-brain barrier. Cell and Tissue Research. 314 (1), (2003).
  20. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for bloodĝ€"brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), (2010).
  21. Alles, Y. C. J., Greggio, S., Alles, R. M., Azevedo, P. N., Xavier, L. L., DaCosta, J. C. A novel preclinical rodent model of collagenase-induced germinal matrix/intraventricular hemorrhage. Brain Research. 1356, (2010).
  22. Christian, E. A., et al. Trends in hospitalization of preterm infants with intraventricular hemorrhage and hydrocephalus in the United States. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 17 (3), 2000-2010 (2016).

Play Video

Cite This Article
Miller, B. A., Pan, S., Yang, P. H., Wang, C., Trout, A. L., DeFreitas, D., Ramagiri, S., Olson, S. D., Strahle, J. M. Modeling Neonatal Intraventricular Hemorrhage Through Intraventricular Injection of Hemoglobin. J. Vis. Exp. (186), e63345, doi:10.3791/63345 (2022).

View Video