Modellering av neonatal intraventrikulär blödning genom intraventrikulär injektion av hemoglobin
Summary
Vi presenterar en modell av neonatal intraventrikulär blödning med hjälp av råttungar som efterliknar den patologi som ses hos människor.
Abstract
Neonatal intraventrikulär blödning (IVH) är en vanlig följd av för tidig födsel och leder till hjärnskada, posthemorragisk hydrocefalus (PHH) och livslånga neurologiska underskott. Medan PHH kan behandlas med tillfälliga och permanenta cerebrospinalvätska (CSF) avledningsprocedurer (ventrikulär reservoar respektive ventrikuloperitoneal shunt), finns det inga farmakologiska strategier för att förebygga eller behandla IVH-inducerad hjärnskada och hydrocefalus. Djurmodeller behövs för att bättre förstå patofysiologin hos IVH och testa farmakologiska behandlingar. Även om det finns befintliga modeller av neonatal IVH, är de som på ett tillförlitligt sätt resulterar i hydrocephalus ofta begränsade av nödvändigheten av stora volyminjektioner, vilket kan komplicera modelleringen av patologin eller införa variation i den kliniska fenotypen som observerats.
Nya kliniska studier har involverat hemoglobin och ferritin i att orsaka ventrikulär förstoring efter IVH. Här utvecklar vi en enkel djurmodell som efterliknar den kliniska fenotypen av PHH med hjälp av intraventrikulära injektioner med liten volym av blodnedbrytningsprodukten hemoglobin. Förutom att på ett tillförlitligt sätt inducera ventrikulär förstoring och hydrocefalus, resulterar denna modell i skada på vit substans, inflammation och immuncellinfiltration i periventrikulära och vita substansregioner. Detta dokument beskriver denna kliniskt relevanta, enkla metod för modellering av IVH-PHH hos neonatala råttor med intraventrikulär injektion och presenterar metoder för att kvantifiera ventrikelstorlek efter injektion.
Introduction
Neonatal IVH härstammar från germinalmatrisen, en plats för snabb celldelning som ligger intill de laterala ventriklarna i den utvecklande hjärnan. Denna mycket vaskulära struktur är sårbar för hemodynamisk instabilitet relaterad till för tidig födsel. Blod släpps ut i laterala ventriklarna vid germinal matrisblödning (GMH) -IVH när bräckliga blodkärl i germinalmatrisbrottet. När det gäller grad IV IVH kan periventrikulär hemorragisk infarkt också bidra till frisättning av blodprodukter i hjärnan. 1 Kombinationen av GMH-IVH kan orsaka PHH, särskilt efter höggradig blödning (grad III och IV)1. PHH kan behandlas med placering av en ventriculoperitoneal shunt, men shuntplacering vänder inte hjärnskadan som kan uppstå från IVH. Även om modern neonatal intensivvård har sänkt frekvensen av IVH2, 3, finns det inga specifika behandlingar för hjärnskada eller hydrocefalus orsakad av IVH när det har inträffat. En betydande begränsning i utvecklingen av förebyggande behandlingar för IVH-inducerad hjärnskada och PHH är den ofullständiga förståelsen av IVH-patofysiologi.
Nyligen har tidiga CSF-nivåer av viktiga blodnedbrytningsprodukter hemoglobin visat sig vara associerade med den senare utvecklingen av PHH hos nyfödda med högkvalitativ IVH4. Dessutom är CSF-nivåer av järnhanteringsvägsproteiner-hemoglobin, ferritin och bilirubin-associerade med ventrikelstorlek vid neonatal IVH. Detta visades också i en multicenterkohort av spädbarn med prematur PHH, där högre ventrikulära CSF-nivåer av ferritin var associerade med större ventrikelstorlek5.
I denna studie utvecklade vi en kliniskt relevant modell av IVH-inducerad hjärnskada och hydrocefalus som använder hemoglobininjektion i hjärnventriklarna, vilket möjliggör kvantifiering av hjärnskada och PHH och testning av nya terapeutiska strategier (Figur 1)6, 7. Denna IVH-modell använder neonatala råttungar, som placeras under generell anestesi under procedurens varaktighet. Ett snitt i mittlinjen görs i hårbotten, och koordinater som härrör från skallens landmärken – bregma eller lambda – används för att rikta in sig på laterala ventriklarna för injektion. Långsam injektion med en infusionspump levererar hemoglobin i ventrikeln. Detta protokoll är lätt att använda, mångsidigt och kan modellera olika komponenter i IVH som resulterar i PHH.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna IVH-modell som använder hemoglobininjektion möjliggör studier av patologin hos IVH specifikt medierad av hemoglobin. För kompletterande studier kan hemoglobin också enkelt levereras in vitro och förvirrar inte biokemiska analyser för proteiner gjorda av mikroglia / makrofager som finns i helblod.
De ledande teorierna om IVH-PHH inkluderar mekanisk obstruktion av CSF-cirkulationen, störningen av cilia som kantar ependymala väggar, inflammation, fibros och järntoxicitet<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JMS erhöll finansiering från NIH/NINDS R01 NS110793 och K12 (Neurosurgeon Research Career Development Program). BAM fick finansiering från NIH/NINDS K08 NS112580-01A1, University of Kentucky Neuroscience Research Priority Area Award och ett Hydrocephalus Association Innovator Award.
Materials
| 0.3 mL insulin syringe | BD Microfine + Insulin Syringe | 230-4533 | 0.3-0.5 mL synringes will work |
| 1.5 mL microtube | USA Scientific | 1615-5500 | Lot No. K194642H -3 511 |
| 4.7T MRI | Agilent/Varian | 4.7T/33 cm | Agilent/Varian DirectDrive 4.7-T (200-MHz) MRI system |
| 6-0 monofilament suture | ETHICON | 667G | |
| 9.4T MRI | Bruker | BioSpec 94/20 | Used in this protocol without the cryoprobe |
| Analytical balance | CCURIS Instruments | W3200-320 | |
| Artificial CSF (aCSF) | Tocris Bioscience | 3525 | Batch No: 72A |
| Betadine | Purdue Products L.P. | 301005-00 | NDC 67618-150-09 |
| Carprofen (injectable) | Zoetis Inc. | PI 4019448 | Rimadyl |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| Heating pad | Sunbeam | E12107-819 | UL 612A, Z-1228-001 |
| Hemoglobin | MP Biomedicals | 100714 | LOT NO. SR02321 |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Isoflurane vaporizer | VETEQUIP | 911103 | |
| Light for stereotactic insturment | Dolan-Jenner industries | Fiber-Lite MI-150 | |
| Microinjection syringe pump | World Precision Instruments | MICRO21 | Serial 184034 T08K |
| MRI software | Bruker BioSpin | Paravision 360 3.2 | |
| Oxygen | Airgas Healthcare | UN1072 | LOT NUMBER S1432080XA02 |
| Sprague Dawley rats | Charles River Laboratories | Strain code: 001 | |
| Stereotactic instrument | KOPF Instuments | Model 900LS Lazy Susan | |
| Sterile cotton tipped applicator | Fischerbrand | 23-400-118 | |
| Surgical blade | covetrus | #10 | |
| Topical triple antibiotic | Triple Antibiotic Ointment | NDC 51672-2120-1 | |
| Ventricle volume quantification software | ITK-SNAP | ITK-SNAP 4.0.0 beta |
References
- Robinson, S. Neonatal posthemorrhagic hydrocephalus from prematurity: Pathophysiology and current treatment concepts: A review. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 9 (3), (2012).
- Hasselager, A. B., Børch, K., Pryds, O. A. Improvement in perinatal care for extremely premature infants in Denmark from. Danish Medical Journal. 63 (1), (1994).
- Johnston, P. G., Gillam-Krakauer, M., Fuller, M. P., Reese, J. Evidence-Based Use of Indomethacin and Ibuprofen in the Neonatal Intensive Care Unit. Clinics in Perinatology. 39 (1), (2012).
- Mahaney, K. B., Buddhala, C., Paturu, M., Morales, D., Limbrick, D. D., Strahle, J. M. Intraventricular Hemorrhage Clearance in Human Neonatal Cerebrospinal Fluid: Associations with Hydrocephalus. Stroke. , (2020).
- Strahle, J. M., et al. Longitudinal CSF Iron Pathway Proteins in Posthemorrhagic Hydrocephalus: Associations with Ventricle Size and Neurodevelopmental Outcomes. Annals of Neurology. 90 (2), (2021).
- Strahle, J. M., et al. Role of Hemoglobin and Iron in hydrocephalus after neonatal intraventricular hemorrhage. Neurosurgery. 75 (6), (2014).
- Garton, T. P., He, Y., Garton, H. J. L., Keep, R. F., Xi, G., Strahle, J. M. Hemoglobin-induced neuronal degeneration in the hippocampus after neonatal intraventricular hemorrhage. Brain Research. 1635, (2016).
- Goulding, D. S., Caleb Vogel, ., Gensel, R., Morganti, J. C., Stromberg, J. M., Miller, A. J., A, B. Acute brain inflammation, white matter oxidative stress, and myelin deficiency in a model of neonatal intraventricular hemorrhage. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 26 (6), (2020).
- Strahle, J., Garton, H. J. L., Maher, C. O., Muraszko, K. M., Keep, R. F., Xi, G. Mechanisms of Hydrocephalus After Neonatal and Adult Intraventricular Hemorrhage. Translational Stroke Research. 3, (2012).
- Jinnai, M., et al. A Model of Germinal Matrix Hemorrhage in Preterm Rat Pups. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, (2020).
- Georgiadis, P., et al. Characterization of acute brain injuries and neurobehavioral profiles in a rabbit model of germinal matrix hemorrhage. Stroke. 39 (12), (2008).
- Cherian, S. S., Love, S., Silver, I. A., Porter, H. J., Whitelaw, A. G. L., Thoresen, M. Posthemorrhagic ventricular dilation in the neonate: Development and characterization of a rat model. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 62 (3), (2003).
- Balasubramaniam, J., Xue, M., Buist, R. J., Ivanco, T. L., Natuik, S., del Bigio, ., R, M. Persistent motor deficit following infusion of autologous blood into the periventricular region of neonatal rats. Experimental Neurology. (1), (2006).
- Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances. The Lancet Neurology. 8 (1), (2009).
- Dobbing, J., Sands, J. Comparative aspects of the brain growth spurt. Early Human Development. 3 (1), (1979).
- Craig, A., et al. Quantitative analysis of perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Experimental Neurology. 181 (2), (2003).
- Lodygensky, G. A., Vasung, L., Sv Sizonenko, ., Hüppi, P. S. Neuroimaging of cortical development and brain connectivity in human newborns and animal models. Journal of Anatomy. 217 (4), (2010).
- Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Developmental Neuroscience. 33 (34), (2011).
- Engelhardt, B. Development of the blood-brain barrier. Cell and Tissue Research. 314 (1), (2003).
- Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for bloodĝ€"brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), (2010).
- Alles, Y. C. J., Greggio, S., Alles, R. M., Azevedo, P. N., Xavier, L. L., DaCosta, J. C. A novel preclinical rodent model of collagenase-induced germinal matrix/intraventricular hemorrhage. Brain Research. 1356, (2010).
- Christian, E. A., et al. Trends in hospitalization of preterm infants with intraventricular hemorrhage and hydrocephalus in the United States. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 17 (3), 2000-2010 (2016).
