Quantificazione della distribuzione subcellulare del glicogeno nelle fibre muscolari scheletriche mediante microscopia elettronica a trasmissione
Summary
Una procedura post-fissazione modificata aumenta il contrasto delle particelle di glicogeno nei tessuti. Questo documento fornisce un protocollo passo-passo che descrive come gestire il tessuto, condurre l’imaging e utilizzare metodi stereologici per ottenere dati imparziali e quantitativi sulla distribuzione del glicogeno subcellulare specifico della fibra nel muscolo scheletrico.
Abstract
Con l’uso della microscopia elettronica a trasmissione, è possibile ottenere immagini ad alta risoluzione di campioni fissi contenenti singole fibre muscolari. Ciò consente di quantificare aspetti ultrastrutturali come frazioni di volume, rapporti superficie/volume, morfometria e siti di contatto fisico di diverse strutture subcellulari. Nel 1970, un protocollo per la colorazione migliorata del glicogeno nelle cellule è stato sviluppato e ha aperto la strada a una serie di studi sulla localizzazione subcellulare della dimensione delle particelle di glicogeno e glicogeno utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione. Mentre la maggior parte delle analisi interpreta il glicogeno come se fosse distribuito in modo omogeneo all’interno delle fibre muscolari, fornendo solo un singolo valore (ad esempio, una concentrazione media), la microscopia elettronica a trasmissione ha rivelato che il glicogeno è immagazzinato come particelle di glicogeno discrete situate in compartimenti subcellulari distinti. Qui, viene descritto il protocollo passo-passo dalla raccolta dei tessuti alla determinazione quantitativa della frazione di volume e del diametro delle particelle del glicogeno nei distinti compartimenti subcellulari delle singole fibre muscolari scheletriche. Considerazioni su come 1) raccogliere e macchiare campioni di tessuto, 2) eseguire analisi di immagini e gestione dei dati, 3) valutare la precisione delle stime, 4) discriminare tra i tipi di fibre muscolari e 5) sono incluse insidie e limitazioni metodologiche.
Introduction
Le particelle di glicogeno sono composte da polimeri ramificati di glucosio e varie proteine associate1 e costituiscono un combustibile importante durante le elevate richieste metaboliche2. Sebbene non ampiamente riconosciute, le particelle di glicogeno costituiscono anche un combustibile locale, dove alcuni processi subcellulari utilizzano preferenzialmente il glicogeno nonostante la disponibilità di altri e più combustibili di lunga durata come il glucosio plasmatico e gli acidi grassi3,4.
L’importanza di immagazzinare il glicogeno come combustibile localizzato specifico subcellulare è stata discussa in diverse revisioni5,6 basate principalmente su alcune delle prime documentazioni sulla distribuzione subcellulare del glicogeno mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM)7,8. I primi studi hanno utilizzato protocolli diversi per aumentare il contrasto del glicogeno dalle tecniche di colorazione istochimica alle colorazioni negative e positive9,10. Un importante sviluppo metodologico è stato il raffinato protocollo post-fissazione con l’osmio a ridotto ferrocianuro di potassio11,12,13,14, che ha migliorato significativamente il contrasto delle particelle di glicogeno. Questo protocollo raffinato non è stato utilizzato in alcuni dei lavori pionieristici sulla deplezione del glicogeno indotta dall’esercizio15, ma è stato reintrodotto da Graham e colleghi16,17.
Sulla base delle immagini a 2 dimensioni, la distribuzione subcellulare del glicogeno è più spesso descritta come particelle di glicogeno situate in tre pool: subsarcolemmale (appena sotto la membrana superficiale), intermiofibrillare (tra le miofibrille) o intramiofibrillare (all’interno delle miofibrille). Tuttavia, le particelle di glicogeno potrebbero anche essere descritte come associate, ad esempio, al reticolo sarcoplasmatico7 o ai nuclei18. Oltre alla distribuzione subcellulare, il vantaggio del contenuto di glicogeno stimato da TEM è anche che la quantificazione può essere condotta a livello di singola fibra. Ciò consente lo studio della variabilità da fibra a fibra e analisi correlative con tipi di fibre e componenti cellulari come mitocondri e goccioline lipidiche.
Qui, viene descritto il protocollo per il contenuto volumetrico specifico del tipo di fibra stimato TEM dei tre pool subcellulari comuni di glicogeno (subsarcolemmale, intermiofibrillare e intramiofibrillare) nelle fibre muscolari scheletriche. Il metodo è stato applicato ai muscoli scheletrici degli esseri umani19, ratti20 e topi21; così come uccelli e pesci22; e cardiomiociti da ratti23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il passaggio critico del metodo è l’uso di osmio ridotto da ferrocianuro di potassio durante la post-fissazione. La selettività di questo fissativo modificato per il rilevamento del glicogeno non può essere completamente spiegata dalla chimica, ma include anche risultati sperimentali che dimostrano che non è stata rilevata alcuna particella in tessuti noti per essere privi di glicogeno o nello spazio extracellulare11.
I parametri critici sono la precisione delle sti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Comitato Olimpico Svedese.
Materials
| 1,2-Propylene oxide | Merck | 75-56-9 | |
| Embedding 812 resin medium kit | Taab | T031 | |
| Glutaraldehyde solution 25% | Merck | 1.04239.0250 | |
| ITEM | Olympus | Imaging software | |
| Leica EM AC20 | Leica | Automatic contrasting system | |
| OSIS Veleta digital camera | Olympus | ||
| Osmium tetroxide 4% solution | Polysciences | 0972A | |
| Philips CM 100 Transmission EM | Philips | ||
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 455989-245G | |
| Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4 | Ampliqon.com | AMPQ40989.0500 | |
| Ultra-microtome Leica UC7 | Leica | ||
| Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution | Leica | 16707235 | |
| Uranyl acetate dihydrate | Polysciences | 6159-44-0 |
References
- Prats, C., Graham, T. E., Shearer, J. The dynamic life of the glycogen granule. Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7089-7098 (2018).
- Gollnick, P. D., Piehl, K., Saltin, B. Selective glycogen depletion pattern in human muscle fibres after exercise of varying intensity and at varying pedalling rates. Journal of Physiology. 241 (1), 45-57 (1974).
- James, J. H., et al. Stimulation of both aerobic glycolysis and Na+-K+-ATPase activity in skeletal muscle by epinephrine or amylin. American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 277 (1), 176-186 (1999).
- Jensen, R., Nielsen, J., Ørtenblad, N. Inhibition of glycogenolysis prolongs action potential repriming period and impairs muscle function in rat skeletal muscle. Journal of Physiology. 598 (4), 789-803 (2020).
- Green, H. J. How important is endogenous muscle glycogen to fatigue in prolonged exercise. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 69 (2), 290-297 (1991).
- Fitts, R. H. Cellular mechanisms of muscle fatigue. Physiological Reviews. 74 (1), 49-94 (1994).
- Wanson, J. C., Drochmans, P. Role of the sarcoplasmic reticulum in glycogen metabolism. Journal of Cellular Biology. 54 (2), 206-224 (1972).
- Schmalbruch, H., Kamieniecka, Z. Fiber types in the human brachial biceps muscle. Experimental Neurology. 44 (2), 313-328 (1974).
- Drochmans, P. Morphology of glycogen. Electron microscopic study of the negative stains of particulate glycogen. Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).
- Thiery, J. -. P. Demonstration of polysaccharides on thin sections by electron microscopy. Journal of Microscopy. 6, 987-1018 (1967).
- De Bruijn, W. C. Glycogen, its chemistry and morphologic appearance in the electron microscope. I. A modified OsO4 fixative which selectively contrasts glycogen. Journal of Ultrastructural Research. 42 (1), 29-50 (1973).
- Robinson, J. M., Karnovsky, M. L., Karnovsky, M. J. Glycogen accumulation in polymorphonuclear leukocytes, and other intracellular alterations that occur during inflammation. The Journal of Cell Biology. 95 (3), 933-942 (1982).
- Rybicka, K. K. Glycosomes – the organelles of glycogen metabolism. Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).
- Gadisseux, J. F., Evrard, P. Glial-neuronal relationship in the developing central nervous system. A histochemical-electron microscope study of radial glial cell particulate glycogen in normal and reeler mice and the human fetus. Developmental Neuroscience. 7 (1), 12-32 (1985).
- Fridén, J., Seger, J., Ekblom, B. Implementation of periodic acid-thiosemicarbazide-silver proteinate staining for ultrastructural assessment of muscle glycogen utilization during exercise. Cell Tissue Research. 242 (1), 229-232 (1985).
- Marchand, I., et al. Quantification of subcellular glycogen in resting human muscle: granule size, number, and location. Journal of Applied Physiology. 93 (5), 1598-1607 (2002).
- Marchand, I., et al. Quantitative assessment of human muscle glycogen granules size and number in subcellular locations during recovery from prolonged exercise. Journal of Physiology. 580, 617-628 (2007).
- Sun, R. C., et al. Nuclear Glycogenolysis Modulates Histone Acetylation in Human Non-Small Cell Lung Cancers. Cell Metabolism. 30 (5), 903-916 (2019).
- Jensen, R., et al. Heterogeneity in subcellular muscle glycogen utilisation during exercise impacts endurance capacity in men. Journal of Physiology. 598 (19), 4271-4292 (2020).
- Nielsen, J., Schrøder, H. D., Rix, C. G., Ørtenblad, N. Distinct effects of subcellular glycogen localization on tetanic relaxation time and endurance in mechanically skinned rat skeletal muscle fibres. Journal of Physiology. 587 (14), 3679-3690 (2009).
- Nielsen, J., Cheng, A. J., Ørtenblad, N., Westerblad, H. Subcellular distribution of glycogen and decreased tetanic Ca2+ in fatigued single intact mouse muscle fibres. Journal of Physiology. 592 (9), 2003-2012 (2014).
- Mead, A. F., et al. Fundamental constraints in synchronous muscle limit superfast motor control in vertebrates. eLife. 6, 29425 (2017).
- Nielsen, J., Johnsen, J., Pryds, K., Ørtenblad, N., Bøtker, H. E. Myocardial subcellular glycogen distribution and sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling: effects of ischaemia, reperfusion and ischaemic preconditioning. Journal of Muscle Research and Cellular Motility. 42 (1), 17-31 (2021).
- Nielsen, J., Holmberg, H. C., Schrøder, H. D., Saltin, B., Ørtenblad, N. Human skeletal muscle glycogen utilization in exhaustive exercise: role of subcellular localization and fibre type. Journal of Physiology. 589 (11), 2871-2885 (2011).
- Weibel, E. R. . Stereological Methods. Vol. 2: Theoretical Foundations. , (1980).
- Gundersen, H. J., et al. Some new, simple and efficient stereological methods and their use in pathological research and diagnosis. APMIS. 96 (5), 379-394 (1988).
- Saltin, B., Gollnick, P. D. Skeletal muscle adaptability: significance for metabolism and performance. Handbook of Physiology. Skeletal Muscle. 10, 555-632 (1983).
- Howard, C. V., Reed, M. G. . Unbiased Stereology. Three-dimensional Measurement in Microscopy. , (2005).
- Nielsen, J., et al. Subcellular localization-dependent decrements in skeletal muscle glycogen and mitochondria content following short-term disuse in young and old men. American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 299 (6), 1053-1060 (2010).
- Hokken, R., et al. Subcellular localization- and fibre type-dependent utilization of muscle glycogen during heavy resistance exercise in elite power and Olympic weightlifters. Acta Physiologica (Oxford). 231 (2), 13561 (2021).
- Nielsen, J., Farup, J., Rahbek, S. K., de Paoli, F. V., Vissing, K. Enhanced glycogen storage of a subcellular hot spot in human skeletal muscle during early recovery from eccentric contractions. PLoS One. 10 (5), 0127808 (2015).
- Sjöström, M., et al. Morphometric analyses of human muscle fiber types. Muscle Nerve. 5 (7), 538-553 (1982).
- Gejl, K. D., et al. Local depletion of glycogen with supramaximal exercise in human skeletal muscle fibres. Journal of Physiology. 595 (9), 2809-2821 (2017).
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
