透過型電子顕微鏡による骨格筋線維の細胞内グリコーゲン分布の定量化
Summary
修正された固定後手順は、組織中のグリコーゲン粒子のコントラストを増加させる。この論文は、組織を処理し、イメージングを行い、立体学的方法を使用して骨格筋における繊維型特異的な細胞内グリコーゲン分布に関する偏りのない定量的データを得る方法を説明するステップバイステップのプロトコルを提供する。
Abstract
透過型電子顕微鏡を用いることで、個々の筋線維を含む固定試料の高解像度画像を得ることができる。これにより、体積分率、表面積対体積比、モルフォメトリー、および異なる細胞内構造の物理的接触部位などの超構造的側面の定量化が可能になる。1970年代には、細胞内のグリコーゲンの染色を強化するためのプロトコルが開発され、透過型電子顕微鏡を用いたグリコーゲンおよびグリコーゲン粒子径の細胞内局在化に関する一連の研究への道を開いた。ほとんどの分析では、グリコーゲンが筋線維内に均質に分布しているかのように解釈され、単一の値(例えば、平均濃度)しか提供されないが、透過型電子顕微鏡は、グリコーゲンが別個の細胞内区画に位置する個別のグリコーゲン粒子として保存されることが明らかになった。ここでは、組織採取から個々の骨格筋線維の別個の細胞内区画におけるグリコーゲンの体積分率および粒子径の定量的決定までの段階的なプロトコールが記載されている。1)組織標本の収集と染色、2)画像解析とデータ処理の実行、3)推定値の精度の評価、4)筋線維タイプの識別、5)方法論的な落とし穴と限界に関する考慮事項が含まれています。
Introduction
グリコーゲン粒子は、グルコースと様々な関連タンパク質1の分岐ポリマーで構成されており、代謝要求が高い2際に重要な燃料を構成しています。広く認識されていないが、グリコーゲン粒子はまた、血漿グルコースおよび脂肪酸として他のより長期持続性の燃料が利用可能であるにもかかわらず、いくつかの細胞内プロセスがグリコーゲンを優先的に利用する局所燃料を構成する3,4。
グリコーゲンを細胞内特異的局在化燃料として貯蔵することの重要性は、主に透過型電子顕微鏡(TEM)7,8によるグリコーゲンの細胞内分布に関する初期の文書のいくつかに基づいて、いくつかのレビュー5,6で議論されている7,8。最初の研究では、組織化学染色技術から陰性および陽性染色へのグリコーゲンのコントラストを高めるために、異なるプロトコールを使用しました9,10。重要な方法論的発展は、フェロシアン化カリウム還元オスミウム11,12,13,14による精製された固定後プロトコルであり、グリコーゲン粒子のコントラストを有意に改善した。この洗練されたプロトコルは、運動誘発グリコーゲン枯渇に関する先駆的な研究の一部では使用されず15、グラハムと同僚によって再導入されました16,17。
2次元画像に基づいて、グリコーゲンの細胞内分布は、サルコレンマル下(表面膜のすぐ下)、筋原線維間(筋原線維間)、または筋原線維内(筋原線維内)の3つのプールに位置するグリコーゲン粒子として最も頻繁に記述される。しかしながら、グリコーゲン粒子は、例えば筋小胞体7またはnuclei18に関連するものとして記述することもできる。細胞内分布に加えて、TEM推定グリコーゲン含有量の利点は、単繊維レベルで定量を行うことができることである。これにより、繊維間変動性の調査や、ミトコンドリアや脂肪滴などの繊維タイプや細胞成分との相関解析が可能になります。
ここでは、骨格筋線維におけるグリコーゲンの3つの一般的な細胞内プール(筋筋下、筋原線維間、および筋原線維内)のTEM推定線維型特異的体積含量に関するプロトコールが記載されている。この方法は、ヒト19、ラット20、およびマウス21の骨格筋に適用されている。鳥や魚だけでなく22;ラット由来の心筋細胞23。
Protocol
ヒト生検された骨格筋サンプルを用いた本プロトコールは、デンマーク南部の健康研究倫理に関する地域委員会(S-20170198)によって承認された。筋生検は、局所麻酔が皮下投与された後に吸引されたベルグストローム針を用いて バストゥス側方 筋から皮膚の切開を通して得られた(切開部あたり2%のリドカイン1〜3mL)。単離されたラット全筋肉を使用した場合、デンマークのオーデンセ大…
Representative Results
このプロトコルを使用すると、グリコーゲン粒子は黒くはっきりと見えます(図1および図2)。グリコーゲンの正常値を図3に示します。これらのデータは、異なる先行研究で収集された41人の健康な若い男性からの合計362本の繊維に基づいている19、24、29、<sup class="x…
Discussion
この方法の重要なステップは、固定後におけるフェロシアン化カリウムによる還元オスミウムの使用である。グリコーゲン検出のためのこの修飾固定液の選択性は、化学によって完全に説明することはできませんが、グリコーゲンを含まないことが知られている組織または細胞外空間においてそのような粒子が検出されないことを実証する実験的知見も含まれています11。</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業はスウェーデンオリンピック委員会の支援を受けた。
Materials
| 1,2-Propylene oxide | Merck | 75-56-9 | |
| Embedding 812 resin medium kit | Taab | T031 | |
| Glutaraldehyde solution 25% | Merck | 1.04239.0250 | |
| ITEM | Olympus | Imaging software | |
| Leica EM AC20 | Leica | Automatic contrasting system | |
| OSIS Veleta digital camera | Olympus | ||
| Osmium tetroxide 4% solution | Polysciences | 0972A | |
| Philips CM 100 Transmission EM | Philips | ||
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 455989-245G | |
| Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4 | Ampliqon.com | AMPQ40989.0500 | |
| Ultra-microtome Leica UC7 | Leica | ||
| Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution | Leica | 16707235 | |
| Uranyl acetate dihydrate | Polysciences | 6159-44-0 |
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Cite This Article
Jensen, R., Ørtenblad, N., di Benedetto, C., Qvortrup, K., Nielsen, J. Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (180), e63347, doi:10.3791/63347 (2022).