Flexion en porte-à-faux du col fémoral murin

Summary

Le présent protocole décrit le développement d’une plate-forme d’essai reproductible pour les cols fémoraux murins dans une configuration de flexion en porte-à-faux. Des guides imprimés en 3D personnalisés ont été utilisés pour fixer de manière cohérente et rigide les fémurs dans un alignement optimal.

Abstract

Les fractures du col du fémur sont fréquentes chez les personnes atteintes d’ostéoporose. De nombreux modèles murins ont été développés pour évaluer les états pathologiques et les thérapies, avec des tests biomécaniques comme mesure de résultat principal. Cependant, les essais biomécaniques traditionnels se concentrent sur les essais de torsion ou de flexion appliqués à l’arbre médian des os longs. Ce n’est généralement pas le site des fractures à haut risque chez les personnes ostéoporotiques. Par conséquent, un protocole de test biomécanique a été développé qui teste le cou fémoral des fémurs murins dans la charge de flexion en porte-à-faux pour mieux reproduire les types de fractures subies par les patients atteints d’ostéoporose. Étant donné que les résultats biomécaniques dépendent fortement de la direction de charge de flexion par rapport au col du fémur, des guides imprimés en 3D ont été créés pour maintenir un arbre fémoral à un angle de 20 ° par rapport à la direction de charge. Le nouveau protocole a simplifié les tests en réduisant la variabilité de l’alignement (21,6 ° ± 1,5 °, COV = 7,1 %, n = 20) et en améliorant la reproductibilité des résultats biomécaniques mesurés (COV moyen = 26,7 %). La nouvelle approche utilisant les guides imprimés en 3D pour un alignement fiable des échantillons améliore la rigueur et la reproductibilité en réduisant les erreurs de mesure dues au désalignement des échantillons, ce qui devrait minimiser la taille des échantillons dans les études sur l’ostéoporose chez la souris.

Introduction

Le risque de fracture est un problème médical grave associé à l’ostéoporose. Plus de 1,5 million de fractures de fragilité sont signalées chaque année aux États-Unis seulement, avec des fractures survenant à la hanche, en particulier au col du fémur, comme principale fracture ^{de type1}. On estime que 18 % des femmes et 6 % des hommes subiront une fracture du col du fémur au cours de leur ^vie2, et le taux de mortalité à 1 an après la fracture est supérieur à 20 %¹. Par conséquent, les modèles murins qui permettent des tests biomécaniques du col du fémur peuvent convenir à l’étude des fractures de fragilité. Les modèles murins offrent également des outils puissants pour élucider les événements cellulaires et moléculaires traduisibles impliqués dans l’ostéoporose potentiellement. Cela est dû à la disponibilité de rapporteurs génétiques, au gain et à la perte de modèles fonctionnels et à la vaste bibliothèque de techniques moléculaires et de réactifs. Les tests mécaniques sur les os de souris peuvent fournir les mesures de résultats nécessaires pour déterminer la santé des os, les variations génotypiques et phénotypiques qui pourraient expliquer l’étiologie de la maladie, et évaluer les thérapies en fonction des mesures des résultats de la qualité de l’os et du risque de ^fracture3.

L’anatomie du col du fémur crée des scénarios de charge mécanique uniques, qui conduisent généralement à des fractures de flexion (flexion). La tête fémorale est chargée dans la cavité acétabulaire à l’extrémité proximale du fémur. Cela crée un scénario de flexion en porte-à-faux sur le col fémoral, qui est fixé de manière rigide à la tige fémorale ^distalement4. Cela diffère des tests de flexion traditionnels à 3 ou 4 points sur la diaphyse moyenne fémorale. Bien que ces tests soient utiles, ils ne reproduisent pas la charge qui conduit généralement à des fractures de fragilité chez les personnes ostéopéniques et ostéoporotiques en termes de localisation de la fracture ou de scénario de charge.

Pour mieux évaluer le risque de fracture de fragilité chez la souris, il a été cherché à améliorer la reproductibilité des tests de flexion en porte-à-faux du col fémoral murin. Comme on l’avait prédit théoriquement, il a été démontré que l’angle de charge sur la tête fémorale par rapport à l’arbre fémoral influe de manière significative sur les mesures des ^résultats5, créant ainsi un défi pour la fiabilité et la reproductibilité des résultats rapportés. Pour assurer un alignement correct et cohérent des fémurs pendant la préparation de l’échantillon, des guides ont été conçus et imprimés en 3D sur la base de mesures anatomiques effectuées sur des scans μCT de fémurs de souris C57BL/6. Les guides ont été conçus pour aider à rempoter systématiquement les échantillons de manière à ce que l’arbre fémoral soit maintenu à ~ 20 ° de la direction de chargement verticale. Cet angle a été choisi parce qu’il maximise la rigidité tout en minimisant le moment de flexion maximal le long de l’arbre fémoral, ce qui augmente le risque de fractures du col du fémur et conduit à des tests plus cohérents et ^{reproductibles5}. Les guides ont été imprimés en 3D dans différentes tailles pour tenir compte des différences anatomiques entre les échantillons et utilisés pour maintenir les échantillons dans une position stable tout en rempotant dans du ciment osseux acrylique. La rigidité, la force maximale, la force d’élasticité et l’énergie maximale ont été calculées à partir des graphiques force-déplacement. Cette méthode d’essai a montré des résultats cohérents pour le résultat biomécanique susmentionné. Avec la pratique et l’aide du guide imprimé en 3D, les erreurs de mesure dues à un désalignement peuvent être minimisées, ce qui permet d’obtenir des mesures de résultats fiables.

Protocol

Les études sur les animaux ont été approuvées par le Comité des ressources animales de l’Université de Rochester. Les souris utilisées dans cette étude étaient des mâles et des femelles C57BL/6 âgés de 24 à 29 semaines. Les souris ont été logées dans des conditions standard avec de la nourriture et de l’eau ad libitum. Lors de l’euthanasie par inhalation de dioxyde de carbone, suivie d’une luxation cervicale, 20 fémurs droits (10 mâles et 10 femelles) ont été récoltés et congelés à -20 °C…

Representative Results

Lorsqu’ils étaient mis en pot à l’aide du guide, les arbres fémoraux étaient alignés à 21,6° ± 1,5°. Bien que cela représente un écart de <10 % par rapport à l’angle prévu de 20°, les coefficients de variation (COV) de l’angle d’empotage sur tous les échantillons testés étaient de 7,6 % et 6,5 % pour les souris mâles et femelles, respectivement (n = 10 par groupe), tels que vérifiés par les radiographies planes pré-test (Figure 5). De plus, les rayons X post-te…

Discussion

Ce protocole décrit un test de flexion en porte-à-faux fiable pour les cols fémoraux murins. Le scénario de flexion naturelle en porte-à-faux qui se produit au niveau du col du fémur n’est généralement pas représenté dans les tests de flexion standard à 3 et 4 ^points5. Cette méthode de test est meilleure et reproduit de manière plus fiable le type de fractures du col du fémur subies par les patients atteints de fragilité osseuse. L’objectif principal lors de l’exécution de ce…

Materials

¼” x ¼” square aluminum tubing	Grainger	48KU67	Cut to lengths of 1/2" to 1" lengths
1 kN load cell	Instron	2527-130	Any load cell with sub 1 N resolution can be used.
3.5x-45x Zoom Stereo Boom Microscope	Omano	OM2300S-GX4	Microscope used to precisely line up samples with loading platen.
3D printed guides	Custom made		Angled slots at 73.13°, with diameters between 1.9 mm and 2.2 mm
3D printed mount	Custom made		Tapped with M10 threads to fit the mount attachment and with 2 M4 threaded holes adjacent sides to hold the aluminum tubing with sample in place.
Acrylic Base Plate Material Kit	Keystone Industries	921392	Mix 3.5 g of powder with 2 mL of liquid. This will be enough for approximately 8 samples, and will begin to harden quickly.
Amira	ThermoFisher Scientific		Used to compile µCT scans
Biaxial stage	Custom made		Used to center femoral head of sample under the loading platen.
BioMed Amber Resin	formlabs	RS-F2-BMAM-01	Any resin from formlabs could be used for this project.
Bluehill 3	Instron	V3.66	Software used to set up loading protocol and collect load, displacement and time data.
ElectroPuls 10000	Instron	E10000	Mechanical testing system
Faxitron UltraFocus	Faxitron BioOptics	2327A40311	X-ray imaging system
Form 2	formlabs	F2	Used to print the mount and guides
Form 2 Resin Tank LT	formlabs	RT-F2-02	LT Tank was used to be compatible with the BioMed Resin
ImageJ	National Institutes of Health	ImageJ	Used to assess µCT and X-ray images
Laxco iLED Series LED Light Source	ThermoFisher Scientific	AMPSILED30W	Light source used in conjugtion with microscope.
Loading platen	Custom made		This can be any metal rod that is tapered to a diameter of approximately 2.5 mm. We used an M6 screw that was tapered on a lathe.
Mount attachment	Custom made		To secure the 3D printed mount to the load cell. We used a M10/M6 threaded rod
Phosphate Buffer Saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	10010031	Need to rehydrate the samples once acrylic base plate material has set.
Plumber's putty	Oatey	31174	Used to seal the end of the aluminum tubing when pouring acrylic base plate material in. Any clay or putty could be used.
PreForm	formlabs	Preform 3.15.2	Formlabs software
Tissue Culture Dish	Corning	353003	Samples can be laid flat in culture dish and covered in PBS to rehydrate.
vivaCT 40	Scanco	µCT 40	Representative set or actual samples can be scanned prior to printing of guides to calculate femoral shaft angle and diameter.