Flexión en voladizo de cuellos femorales murinos

Summary

El presente protocolo describe el desarrollo de una plataforma de prueba reproducible para cuellos femorales murinos en una configuración de flexión en voladizo. Se utilizaron guías personalizadas impresas en 3D para fijar de manera consistente y rígida los fémures en una alineación óptima.

Abstract

Las fracturas en el cuello femoral son una ocurrencia común en individuos con osteoporosis. Se han desarrollado muchos modelos de ratón para evaluar los estados de la enfermedad y las terapias, con pruebas biomecánicas como medida de resultado primaria. Sin embargo, las pruebas biomecánicas tradicionales se centran en las pruebas de torsión o flexión aplicadas al eje medio de los huesos largos. Este no suele ser el sitio de fracturas de alto riesgo en individuos osteoporóticos. Por lo tanto, se desarrolló un protocolo de pruebas biomecánicas que prueba los cuellos femorales de los fémures murinos en la carga de flexión en voladizo para replicar mejor los tipos de fracturas experimentadas por los pacientes con osteoporosis. Dado que los resultados biomecánicos dependen en gran medida de la dirección de carga de flexión en relación con el cuello femoral, se crearon guías impresas en 3D para mantener un eje femoral en un ángulo de 20 ° en relación con la dirección de carga. El nuevo protocolo simplificó las pruebas al reducir la variabilidad en la alineación (21.6 ° ± 1.5 °, COV = 7.1%, n = 20) y mejoró la reproducibilidad en los resultados biomecánicos medidos (COV promedio = 26.7%). El nuevo enfoque que utiliza las guías impresas en 3D para una alineación confiable de las muestras mejora el rigor y la reproducibilidad al reducir los errores de medición debido a la desalineación de las muestras, lo que debería minimizar los tamaños de las muestras en estudios de osteoporosis en ratones.

Introduction

El riesgo de fractura es una preocupación médica grave asociada con la osteoporosis. Más de 1.5 millones de fracturas por fragilidad se reportan cada año solo en los Estados Unidos, con fracturas que ocurren en la cadera, específicamente en el cuello femoral, como el tipo de fractura ^principal1. Se estima que el 18% de las mujeres y el 6% de los hombres experimentarán una fractura de cuello femoral en su ^vida2, y la tasa de mortalidad a 1 año después de la fractura es superior al 20%¹. Por lo tanto, los modelos de ratón que permiten realizar pruebas biomecánicas del cuello femoral pueden ser adecuados para estudiar fracturas por fragilidad. Los modelos de ratón también ofrecen herramientas poderosas para dilucidar potencialmente eventos celulares y moleculares traducibles involucrados en la osteoporosis. Esto se debe a la disponibilidad de reporteros genéticos, la ganancia y pérdida de modelos de función y la amplia biblioteca de técnicas moleculares y reactivos. Las pruebas mecánicas de huesos de ratón pueden proporcionar las medidas de resultado necesarias para determinar la salud ósea, las variaciones genotípicas y fenotípicas que podrían explicar la etiología de la enfermedad, y evaluar las terapias basadas en medidas de resultado de la calidad del hueso y el riesgo de ^fractura3.

La anatomía del cuello femoral crea escenarios de carga mecánica únicos, que generalmente conducen a fracturas de flexión (flexión). La cabeza femoral se carga en la cavidad acetabular en el extremo proximal del fémur. Esto crea un escenario de flexión en voladizo en el cuello femoral, que está rígidamente unido al eje femoral ^distalmente4. Esto difiere de las pruebas tradicionales de flexión de 3 o 4 puntos en la diáfisis media femoral. Si bien estas pruebas son útiles, no replican la carga que generalmente conduce a fracturas por fragilidad en individuos osteopénicos y osteoporóticos en términos de ubicación de la fractura o el escenario de carga.

Para evaluar mejor el riesgo de fractura por fragilidad en ratones, se buscó mejorar la reproducibilidad de las pruebas de flexión en voladizo de cuellos femorales murinos. Como se predijo teóricamente, se ha demostrado que el ángulo de carga en la cabeza femoral en relación con el eje femoral afecta significativamente las medidas de ^resultado5, creando así un desafío para la confiabilidad y reproducibilidad de los resultados informados. Para garantizar una alineación adecuada y consistente de los fémures durante la preparación de la muestra, se diseñaron guías y se imprimieron en 3D en función de las mediciones anatómicas realizadas en exploraciones μCT de fémures de ratón C57BL / 6. Las guías fueron diseñadas para ayudar a colocar consistentemente las muestras de tal manera que el eje femoral se mantenga a ~ 20 ° de la dirección de carga vertical. Este ángulo fue elegido porque maximiza la rigidez al tiempo que minimiza el momento máximo de flexión a lo largo del eje femoral, lo que aumenta la probabilidad de fracturas de cuello femoral y conduce a pruebas más consistentes y reproducibles5. Las guías se imprimieron en 3D en varios tamaños para acomodar las diferencias anatómicas entre las muestras y se utilizaron para mantener las muestras en una posición estable mientras se colocaban en macetas de cemento óseo acrílico. La rigidez, la fuerza máxima, la fuerza de rendimiento y la energía máxima se calcularon a partir de los gráficos de fuerza-desplazamiento. Este método de prueba mostró resultados consistentes para el resultado biomecánico antes mencionado. Con la práctica y la ayuda de la guía impresa en 3D, los errores de medición debidos a la desalineación se pueden minimizar, lo que resulta en medidas de resultado confiables.

Protocol

Los estudios en animales fueron aprobados por el Comité de Recursos Animales de la Universidad de Rochester. Los ratones utilizados en este estudio fueron machos y hembras C57BL/6 con edades comprendidas entre las 24 y las 29 semanas de edad. Los ratones fueron alojados en condiciones estándar con comida y agua ad libitum. Tras la eutanasia por inhalación de dióxido de carbono, seguida de luxación cervical, se cosecharon 20 fémures derechos (10 machos y 10 hembras) y se congelaron a -20 °C hasta que se pr…

Representative Results

Cuando se colocaron en macetas con la ayuda de la guía, los ejes femorales se alinearon a 21.6 ° ± 1.5 °. Si bien esto representa una desviación del <10% del ángulo previsto de 20 °, los coeficientes de variación (COV) del ángulo de maceta en todas las muestras analizadas fueron del 7,6% y el 6,5% para ratones machos y hembras, respectivamente (n = 10 por grupo) según lo verificado por radiografías planas previas a la prueba (Figura 5). Además, las radiografías posteriores a la …

Discussion

Este protocolo describe una prueba confiable de flexión en voladizo para cuellos femorales murinos. El escenario de flexión en voladizo natural que ocurre en el cuello femoral generalmente no está representado en las pruebas estándar de flexión de 3 y 4 ^puntos5. Este método de prueba es mejor y replica de manera más confiable el tipo de fracturas de cuello femoral experimentadas por pacientes con fragilidad ósea. El enfoque principal al realizar este protocolo es eliminar la variabilidad d…

Materials

¼” x ¼” square aluminum tubing	Grainger	48KU67	Cut to lengths of 1/2" to 1" lengths
1 kN load cell	Instron	2527-130	Any load cell with sub 1 N resolution can be used.
3.5x-45x Zoom Stereo Boom Microscope	Omano	OM2300S-GX4	Microscope used to precisely line up samples with loading platen.
3D printed guides	Custom made		Angled slots at 73.13°, with diameters between 1.9 mm and 2.2 mm
3D printed mount	Custom made		Tapped with M10 threads to fit the mount attachment and with 2 M4 threaded holes adjacent sides to hold the aluminum tubing with sample in place.
Acrylic Base Plate Material Kit	Keystone Industries	921392	Mix 3.5 g of powder with 2 mL of liquid. This will be enough for approximately 8 samples, and will begin to harden quickly.
Amira	ThermoFisher Scientific		Used to compile µCT scans
Biaxial stage	Custom made		Used to center femoral head of sample under the loading platen.
BioMed Amber Resin	formlabs	RS-F2-BMAM-01	Any resin from formlabs could be used for this project.
Bluehill 3	Instron	V3.66	Software used to set up loading protocol and collect load, displacement and time data.
ElectroPuls 10000	Instron	E10000	Mechanical testing system
Faxitron UltraFocus	Faxitron BioOptics	2327A40311	X-ray imaging system
Form 2	formlabs	F2	Used to print the mount and guides
Form 2 Resin Tank LT	formlabs	RT-F2-02	LT Tank was used to be compatible with the BioMed Resin
ImageJ	National Institutes of Health	ImageJ	Used to assess µCT and X-ray images
Laxco iLED Series LED Light Source	ThermoFisher Scientific	AMPSILED30W	Light source used in conjugtion with microscope.
Loading platen	Custom made		This can be any metal rod that is tapered to a diameter of approximately 2.5 mm. We used an M6 screw that was tapered on a lathe.
Mount attachment	Custom made		To secure the 3D printed mount to the load cell. We used a M10/M6 threaded rod
Phosphate Buffer Saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	10010031	Need to rehydrate the samples once acrylic base plate material has set.
Plumber's putty	Oatey	31174	Used to seal the end of the aluminum tubing when pouring acrylic base plate material in. Any clay or putty could be used.
PreForm	formlabs	Preform 3.15.2	Formlabs software
Tissue Culture Dish	Corning	353003	Samples can be laid flat in culture dish and covered in PBS to rehydrate.
vivaCT 40	Scanco	µCT 40	Representative set or actual samples can be scanned prior to printing of guides to calculate femoral shaft angle and diameter.