Den intravitale billeddannelsesmetode, der er beskrevet her, anvender kollagen anden harmonisk generation og endogen fluorescens fra den metaboliske co-faktor NAD (P) H til ikke-invasivt at segmentere et umærket tumormikromiljø i tumor-, stromal- og vaskulære rum til dybdegående analyse af 4D-intravitale billeder.
Evnen til at visualisere komplekse og dynamiske fysiologiske interaktioner mellem adskillige celletyper og den ekstracellulære matrix (ECM) inden for et levende tumormikromiljø er et vigtigt skridt i retning af at forstå mekanismer, der regulerer tumorprogression. Selvom dette kan opnås gennem nuværende intravitale billeddannelsesteknikker, er det stadig udfordrende på grund af vævets heterogene karakter og behovet for rumlig kontekst inden for den eksperimentelle observation. Til dette formål har vi udviklet en intravital billeddannelsesarbejdsgang, der parrer kollagen anden harmonisk generationsbilleddannelse, endogen fluorescens fra den metaboliske co-faktor NAD (P) H og fluorescens levetidsbilleddannelsesmikroskopi (FLIM) som et middel til ikke-invasivt at opdele tumormikromiljøet i grundlæggende domæner af tumorreden, den omgivende stroma eller ECM og vaskulaturen. Denne ikke-invasive protokol beskriver den trinvise proces, der spænder fra erhvervelse af time-lapse-billeder af brysttumormodeller til efterbehandlingsanalyse og billedsegmentering. Den primære fordel ved denne arbejdsgang er, at den udnytter metaboliske signaturer til at kontekstualisere det dynamisk skiftende levende tumormikromiljø uden brug af eksogene fluorescerende etiketter, hvilket gør det fordelagtigt for humane patientafledte xenograft (PDX) modeller og fremtidig klinisk brug, hvor ydre fluoroforer ikke er let anvendelige.
Den ekstracellulære matrix (ECM) i tumormikromiljøet er kendt for at være dynamisk deponeret og ombygget af flere celletyper for yderligere at lette sygdomsprogression 1,2,3. Disse matrixændringer giver både mekaniske og biologiske signaler, der ændrer celleadfærd og ofte resulterer i en fortsat cyklus af matrixombygning4. Undersøgelse af det dynamiske, gensidige samspil mellem tumorceller og den ekstracellulære matrix udføres ofte ved hjælp af tredimensionel (3D) in vitro-kultur eller mikrofluidiske systemer. Mens disse bottom-up-tilgange har vist mekanismer til ECM-ombygning 5,6,7, øget proliferation8, epitel til mesenkym overgang 9,10,11,12 og tumorcellemigration og invasion 7,13,14,15,16 , har deres fokus primært været på nogle få celletyper (f.eks. Tumorceller eller fibroblaster) inden for en homogen 3D-matrix sammenlignet med mangfoldigheden og heterogeniteten af interaktioner, der er til stede i et fysiologisk væv. Ud over in vitro-systemer kan ex vivo tumor histologi også give en vis indsigt i disse celle-celle og celle-ECM-interaktioner17. Immunohistokemi har den fordel, at den er i stand til at analysere flere celletyper med hensyn til ECM’s rumligt heterogene sammensætning og arkitektur, men de statiske endepunkter for fast væv fanger ikke den dynamiske karakter af interaktioner mellem celler og mikromiljøet. Intravital billeddannelse har åbnet døren for at forhøre forskellige og dynamiske interaktioner inden for den fysiologiske kontekst af det oprindelige tumormikromiljø.
Mulighederne for intravital tumorbilleddannelse skrider hurtigt frem. Forbedringer i designet af billeddannelsesvinduer og kirurgiske teknikker til implantering af vinduerne har muliggjort langsigtet langsgående tumorbilleddannelse på en række anatomiske steder (dvs. primær tumor, lymfeknuder, metastatiske steder 18,19,20). Desuden bliver optisk instrumenterings kapacitet til at visualisere og indsamle data i flere dimensioner (dvs. spektral, rumlig fluorescensintensitet og levetid) og ved høj opløsning og hastighed (videohastighed) bredt tilgængelig. Den forbedrede teknologi giver mulighed for at udforske hurtige ændringer i cellesignalering og fænotypisk dynamik inden for et fysiologisk miljø. Endelig giver udvidelsen af optogenetiske værktøjer og den brede vifte af genetiske fluorescerende konstruktioner mulighed for mærkning af specifikke celletyper for at fange cellemigration i tumormikromiljø- eller celleafstamningssporing under udvikling eller sygdomsprogression21,22. Brugen af disse værktøjer i kombination med CRISPR/Cas9-teknologien giver forskerne mulighed for at generere unikke dyremodeller i tide.
Mens alle disse fremskridt gør intravital billeddannelse til en stadig mere kraftfuld metode til at udforske dynamiske og fysiologiske cellulære interaktioner, er der stadig et vigtigt behov for at udvikle strategier, der giver rumlig, tidsmæssig og strukturel kontekst på vævsniveau til disse biologiske interaktioner. I øjeblikket kompenserer mange intravitale billeddannelsesundersøgelser for manglen på visuelle landemærker såsom blodkar ved at injicere fluorescerende farvestoffer i vaskulaturen eller anvende musemodeller, der eksogent udtrykker fluorescerende proteiner for at afgrænse fysiske træk. Injicerbare farvestoffer og substrater som fluorescerende dextrans anvendes bredt til med succes at mærke vaskulaturen i intravitale samlinger19, 23, 24. Denne tilgang er imidlertid ikke uden begrænsninger. For det første kræver det yderligere musemanipulationer, og dets anvendelighed er begrænset til kortsigtede eksperimenter. Til langsgående undersøgelser kan fluorescerende dextran være problematisk, da vi observerer akkumuleringen af dextran i fagocytiske celler eller diffusion i det omgivende væv over tid25. Eksogen fluorescerende proteininkorporering i musemodellen er blevet præsenteret som et alternativ til fluorescerende dextrans, men præsenterer sine egne begrænsninger. Tilgængeligheden og mangfoldigheden af eksogene fluoroforer i musemodeller er stadig begrænset og dyr at skabe. Derudover er genetiske manipulationer i specifikke modeller, såsom PDX-modeller, ikke ønskelige eller mulige. Det har også vist sig, at tilstedeværelsen af fluorescerende eller bioluminescerende proteiner i celler anerkendes som fremmede i musen, og inden for immunkompetente musemodeller reducerer dette mængden af metastase på grund af værtsimmunsystemets respons26,27. Endelig optager eksogene fluorescerende proteiner eller fluorescerende farvestoffer, der anvendes til rumlig kontekst eller til at segmentere efterfølgende data, ofte primære områder af lysspektret, der ellers kunne bruges til at undersøge de fysiologiske interaktioner af interesse.
Anvendelsen af det indre signal fra ECM eller endogen fluorescens fra celler i vævet repræsenterer et potentielt universelt etiketfrit middel til at segmentere intravitale data til mere dybtgående cellulær og rumlig analyse. Anden harmoniske generation (SHG) har længe været brugt til at visualisere ECM28. Med den efterfølgende udvikling af vigtige værktøjer til at hjælpe med karakteriseringen af fiberorganisation 29,30,31 er det muligt at karakterisere celleadfærd i forhold til lokal ECM-struktur. Derudover giver autofluorescens fra den endogene metabolit, NAD (P) H, et andet etiketfrit værktøj til at opdele tumormikromiljøet in vivo. NAD(P)H fluorescerer kraftigt i tumorceller og kan bruges til at skelne grænserne for den voksende tumorrede fra den omgivende stroma21,32. Endelig er vaskulaturen en vigtig fysiologisk struktur i tumormikromiljøet og stedet for nøglecelletypespecifikke interaktioner 33,34,35. Excitationen af røde blodlegemer (RBC) eller blodplasma er blevet brugt til at visualisere tumorvaskulaturen, og ved hjælp af to- eller tre-foton-excitation (2P; 3P) har målingen af blodgennemstrømningshastigheder vist sig at være mulig36. Men mens større blodkar let kan identificeres ved deres endogene fluorescenssignaturer, kræver identifikationen af subtile, variable og mindre fluorescerende små blodkar mere ekspertise. Disse iboende vanskeligheder hindrer optimal billedsegmentering. Heldigvis kan disse kilder til endogen fluorescens (dvs. røde blodlegemer og blodplasma) også måles ved fluorescenslevetidsbilleddannelse 37, som udnytter vaskulaturens unikke fotofysiske egenskaber og repræsenterer en nyttig tilføjelse til den voksende intravitale værktøjskasse.
I denne protokol beskrives en arbejdsgang til segmentering af firedimensionel (4D) intravital billeddannelse eksplicit ved hjælp af iboende signaler som endogen fluorescens og SHG fra erhvervelse til analyse. Denne protokol er især relevant for langsgående undersøgelser gennem et brystbilleddannelsesvindue, hvor eksogen fluorescens muligvis ikke er praktisk eller mulig, som det er tilfældet med PDX-modeller. De segmenteringsprincipper, der er skitseret her, er imidlertid bredt anvendelige for intravitale brugere, der undersøger tumorbiologi, vævsudvikling eller endda normal vævsfysiologi. Den rapporterede pakke af analysemetoder vil give brugerne mulighed for at differentiere cellulær adfærd mellem regioner med justerede eller tilfældige kollagenfiberkonfigurationer, sammenligne tal eller adfærd af celler, der er bosiddende i bestemte regioner i tumormikromiljøet, og kortlægge vaskulaturen til tumormikromiljøet ved kun at bruge etiketfrit eller iboende signal. Sammen skaber disse metoder en operationel ramme for at maksimere dybden af information opnået ved 4D intravital billeddannelse af brystkirtlen, samtidig med at behovet for yderligere eksogene etiketter minimeres.
4D intravital billeddannelse er et kraftfuldt værktøj til at undersøge dynamiske fysiologiske interaktioner inden for den rumlige og tidsmæssige kontekst af det oprindelige tumormikromiljø. Dette manuskript giver en meget grundlæggende og tilpasningsdygtig operationel ramme til opdeling af dynamiske celleinteraktioner inden for tumormassen, den tilstødende stroma eller i nærheden af det vaskulære netværk ved kun at bruge endogene signaler fra anden harmonisk generation eller NAD (P) H autofluorescens. Denne pro…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende NCI R01 CA216248, CA206458 og CA179556 tilskud til finansiering af dette arbejde. Vi vil også gerne anerkende Dr. Kevin Eliceiri og hans billedbehandlingsgruppe for deres tekniske ekspertise i den tidlige udvikling af vores intravitale program. Vi takker også Dr. Ben Cox og andre medlemmer af Eliceiri Fabrication Group ved Morgridge Institute for Research for deres væsentlige tekniske design i de tidlige faser af MIW. Dr. Ellen Dobson hjalp med nyttige samtaler om ImageJ-træningsværktøjet WEKA-segmenteringsværktøj. Derudover vil vi gerne takke Dr. Melissa Skala og Dr. Alexa Barres-Heaton for rettidig brug af deres mikroskop. Til sidst vil vi gerne takke Dr. Brigitte Raabe, D.V.M, for alle de tankevækkende diskussioner og råd om vores musehåndtering og -pleje.
#1.5 12mm round cover glass | Warner Instruments | # 64-0712 | MIW construction |
1.0 mL syringe for SQ injection | BD | 309659 | Syringe |
20x objective | Zeiss | 421452-988 | Water immersion |
27G needle for SQ injection | Covidien | 1188827012 | Needle |
40x objective | Nikon | MRD77410 | Water immersion |
5-0 silk braided suture | Ethicon | K870 | Suture for MIW implantation |
Artificial tears gel | Akorn | NDC 59399-162-35 | Eye gel |
Betadine solution, 5% | Fisher Scientific | NC1558063 | Surgery antiseptic |
cotton-tipped applicator | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 1365882 | MIW construction |
fluorescent dextran | Sigma | T1287-50mg | intravenous labelling of vasculature |
forceps | Mckesson.com | Miltex #18-782 | stainless, 4 inch, curved |
GaAsP photomultiplier tube | Hamamatsu | ||
heating blanket | CARA 72 heating pad | 038056000729 | Temperature selectable |
heating chamber | home built | ||
Fluorescent lifetime handbook | Becker and Hickl | https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks | |
inverted microscope base | Nikon | ||
Isoflurane | Akorn | NDC 59399-106-01 | Anesthesia |
Liqui-Nox | Fisher Scientific | 16-000-125 | MIW cleaning |
Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | Analgesic |
Micro Hose | Scientific Commodities INC. | BB31695-PE/1 | |
multiphoton scan head | Bruker Ultima II | Multiphoton scanhead and imaging platform | |
NADH FLIM filter | Chroma | 284994 | ET 440/80 m-2P |
Nair | CVS | 339826 | Depilatory cream |
objective heater | Tokai Hit | STRG-WELSX-SET | |
SHG/FAD filter | Chroma | 320740 | ET450/40m-2P |
Sparkle glass cleaner | Amazon.com | B00814ME24 | Glass Cleaner for implanted MIW |
SPC-150 photon counting board | Becker and Hickl | ||
surgical light | FAJ | B06XV1VQVZ | Magnetic LED gooseneck light |
surgical micro-scissors | Excelta | 366 | stainless, 3 inch |
Triple antibiotic ointment | Actavis Pharma | NDC 0472-0179-34 | Antibiotic |
TV catheter | Custom | BD 30G needle: 305106 | Catheter for TV injection |
Two photon filter | Chroma | 320282 | ET585/65m-2P |
two-photon laser | Coherent charmeleon | Tunable multiphoton laser | |
ultrasound gel | Parker | PKR-03-02 | Water immersion gel |
Urea crystals | Sigma | U5128-5G | Optional: FLIM IRF |