JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Cancer Research

Meme Tümörü Mikroçevresinin İntravital Görüntülemesi için Etiketsiz Bir Segmentasyon Yaklaşımı

Published: May 24, 2022
doi:
10.3791/63413
, , , ,
1Department of Cell and Regenerative Biology,University of Wisconsin-Madison, 2Department of Pathology,University of Wisconsin-Madison, 3Carbone Cancer Center,University of Wisconsin-Madison

Summary

Burada tarif edilen intravital görüntüleme yöntemi, 4D intravital görüntülerin derinlemesine analizi için etiketlenmemiş bir tümör mikroçevresini tümör, stromal ve vasküler kompartmanlara invaziv olmayan bir şekilde segmentlere ayırmak için metabolik ko-faktör NAD (P) H’den kollajen ikinci harmonik jenerasyonu ve endojen floresanı kullanır.

Abstract

Canlı bir tümör mikroortamında çok sayıda hücre tipi ve hücre dışı matriks (ECM) arasındaki karmaşık ve dinamik fizyolojik etkileşimleri görselleştirme yeteneği, tümör progresyonunu düzenleyen mekanizmaları anlamak için önemli bir adımdır. Bu, mevcut intravital görüntüleme teknikleriyle gerçekleştirilebilse de, dokuların heterojen doğası ve deneysel gözlem içindeki mekansal bağlama duyulan ihtiyaç nedeniyle zor olmaya devam etmektedir. Bu amaçla, kollajen ikinci harmonik jenerasyon görüntülemeyi, metabolik ko-faktör NAD(P)H’den endojen floresanı ve floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobunu (FLIM) tümör mikroçevresini tümör yuvasının, çevresindeki stroma veya ECM’nin ve vaskülatürün temel alanlarına invaziv olmayan bir şekilde bölümlere ayırmak için bir araç olarak eşleştiren intravital bir görüntüleme iş akışı geliştirdik. Bu non-invaziv protokol, meme tümörü modellerinin hızlandırılmış görüntülerinin elde edilmesinden işlem sonrası analiz ve görüntü segmentasyonuna kadar uzanan adım adım süreci detaylandırır. Bu iş akışının birincil avantajı, eksojen floresan etiketler kullanmadan dinamik olarak değişen canlı tümör mikro ortamını bağlamsallaştırmak için metabolik imzalardan yararlanmasıdır, bu da onu insan kaynaklı ksenogreft (PDX) modelleri ve dışsal floroforların kolayca uygulanamadığı gelecekteki klinik kullanım için avantajlı hale getirir.

Introduction

Tümör mikroortamındaki hücre dışı matriksin (ECM), hastalığın ilerlemesini daha da kolaylaştırmak için çoklu hücre tipleri tarafından dinamik olarak biriktirildiği ve yeniden şekillendirildiği bilinmektedir 1,2,3. Bu matris değişiklikleri, hücre davranışını değiştiren ve sıklıkla matris yeniden şekillenmesinin devam eden bir döngüsüyle sonuçlanan hem mekanik hem de biyolojik ipuçları sağlar4. Tümör hücreleri ve hücre dışı matriks arasındaki dinamik, karşılıklı etkileşimin araştırılması genellikle üç boyutlu (3D) in vitro kültür veya mikroakışkan sistemler kullanılarak gerçekleştirilir. Bu aşağıdan yukarıya yaklaşımlar ECM yeniden şekillenme mekanizmalarını göstermiş olsa da 5,6,7, artmış proliferasyon8, epitelden mezenkimal geçişegeçiş 9,10,11,12 ve tümör hücresi migrasyonu ve invazyonu 7,13,14,15,16 , odak noktaları öncelikle fizyolojik bir doku içinde bulunan etkileşimlerin çeşitliliği ve heterojenliği ile karşılaştırıldığında homojen bir 3D matris içindeki birkaç hücre tipi (örneğin, tümör hücreleri veya fibroblastlar) üzerinde olmuştur. İn vitro sistemlere ek olarak, ex vivo tümör histolojisi de bu hücre-hücre ve hücre-ECM etkileşimleri hakkında bazı bilgiler sağlayabilir17. İmmünohistokimya, ECM’nin mekansal olarak heterojen bileşimi ve mimarisi açısından çoklu hücre tiplerini analiz edebilme avantajına sahiptir, ancak sabit dokunun statik sonlanım noktaları, hücreler ve mikroçevre arasındaki etkileşimlerin dinamik doğasını yakalamaz. İntravital görüntüleme, doğal tümör mikroçevresinin fizyolojik bağlamı içinde çeşitli ve dinamik etkileşimleri sorgulamak için kapıyı açmıştır.

İntravital tümör görüntülemenin yetenekleri hızla ilerlemektedir. Görüntüleme pencerelerinin tasarımındaki gelişmeler ve pencereleri implante etmek için cerrahi teknikler, çeşitli anatomik lokalizasyonlarda (yani primer tümör, lenf nodları, metastatik bölgeler18,19,20) uzun süreli uzunlamasına tümör görüntülemesini mümkün kılmıştır. Dahası, optik enstrümantasyonun çoklu boyutlarda (yani spektral, uzamsal floresan yoğunluğu ve kullanım ömrü) ve yüksek çözünürlükte ve hızda (video hızı) verileri görselleştirme ve toplama kapasitesi yaygın olarak erişilebilir hale gelmektedir. Gelişmiş teknoloji, fizyolojik bir ortamda hücre sinyalizasyonundaki ve fenotipik dinamiklerdeki hızlı değişiklikleri keşfetme fırsatı sunar. Son olarak, optogenetik araçların genişlemesi ve çok çeşitli genetik floresan yapılar, tümör mikro ortamında hücre göçünü yakalamak için spesifik hücre tiplerinin etiketlenmesine veya gelişim veya hastalık ilerlemesi sırasında hücre soyu izlemesine izin verir21,22. Bu araçların CRISPR / Cas9 teknolojisi ile birlikte kullanılması, araştırmacılara zamanında benzersiz hayvan modelleri oluşturma fırsatı sunar.

Tüm bu ilerlemeler, intravital görüntülemeyi dinamik ve fizyolojik hücresel etkileşimleri keşfetmek için giderek daha güçlü bir yöntem haline getirirken, bu biyolojik etkileşimlere doku düzeyinde mekansal, zamansal ve yapısal bağlam sağlayan stratejiler geliştirmeye hala önemli bir ihtiyaç vardır. Şu anda, birçok intravital görüntüleme çalışması, vaskülatüre floresan boyalar enjekte ederek veya fiziksel özellikleri tanımlamak için floresan proteinleri dışsal olarak eksprese eden fare modellerini kullanarak kan damarları gibi görsel işaretlerin eksikliğini telafi etmektedir. Enjekte edilebilir boyalar ve floresan dekstrans gibi substratlar, intravital koleksiyonlarda vaskülatürü başarılı bir şekilde etiketlemek için yaygın olarak kullanılmaktadır19, 23, 24. Ancak, bu yaklaşım sınırlama olmaksızın değildir. Birincisi, ek fare manipülasyonları gerektirir ve faydası kısa vadeli deneylerle sınırlıdır. Uzunlamasına çalışmalar için, fagositik hücrelerde dekstran birikimini veya zamanla çevre dokuya difüzyonu gözlemlediğimiz için floresan dekstran sorunlu olabilir25. Fare modeline eksojen floresan protein katılımı, floresan dekstransa alternatif olarak sunulmuştur, ancak kendi sınırlamalarını sunmaktadır. Fare modellerindeki eksojen floroforların mevcudiyeti ve çeşitliliği hala sınırlı ve oluşturulması pahalıdır. Ek olarak, PDX modelleri gibi belirli modellerde, genetik manipülasyonlar arzu edilmez veya mümkün değildir. Ayrıca, hücrelerdeki floresan veya biyolüminesan proteinlerin varlığının fare içinde yabancı olarak kabul edildiği ve immünokompetan fare modellerinde, bunun konakçı bağışıklık sisteminin tepkisine bağlı metastaz miktarını azalttığı gösterilmiştir26,27. Son olarak, uzamsal bağlam için veya sonraki verileri segmentlere ayırmak için kullanılan eksojen floresan proteinler veya floresan boyalar, genellikle ilginin fizyolojik etkileşimlerini araştırmak için kullanılabilecek ışık spektrumunun asal aralıklarını işgal eder.

ECM’den gelen içsel sinyalin veya doku içindeki hücrelerden endojen floresanın kullanılması, daha derinlemesine hücresel ve mekansal analiz için intravital verileri segmentlere ayırmak için potansiyel bir evrensel etiketsiz aracı temsil eder. İkinci harmonik jenerasyon (SHG), ECM28’i görselleştirmek için uzun zamandır kullanılmaktadır. Daha sonra fiber organizasyonu 29,30,31’in karakterizasyonuna yardımcı olacak önemli araçların geliştirilmesiyle, yerel ECM yapısına göre hücre davranışını karakterize etmek mümkündür. Ek olarak, endojen metabolitten gelen otofloresan olan NAD (P) H, tümör mikro ortamını in vivo olarak bölümlere ayırmak için başka bir etiketsiz araç sağlar. NAD (P) H, tümör hücrelerinde parlak bir şekilde flüoresan eder ve büyüyen tümör yuvasının sınırlarını çevresindeki stroma21,32’den ayırt etmek için kullanılabilir. Son olarak, vaskülatür, tümör mikroortamında ve anahtar hücre tipine özgü etkileşimlerin yapıldığı yerde önemli bir fizyolojik yapıdır33,34,35. Kırmızı kan hücrelerinin (RBC) veya kan plazmasının uyarılması, tümör vaskülatürünü görselleştirmek için kullanılmıştır ve iki veya üç foton uyarımı (2P; 3P) kullanılarak kan akış hızlarının ölçülmesinin mümkün olduğu gösterilmiştir36. Bununla birlikte, daha büyük kan damarları endojen floresan imzaları ile kolayca tanımlanabilirken, ince, değişken ve daha az floresan küçük kan damarlarının tanımlanması daha fazla uzmanlık gerektirir. Bu doğal zorluklar optimum görüntü segmentasyonunu engeller. Neyse ki, bu endojen floresan kaynakları (yani, kırmızı kan hücreleri ve kan plazması), vaskülatürün benzersiz fotofiziksel özelliklerinden yararlanan ve büyüyen intravital alet kutusuna yararlı bir katkı sağlayan floresan ömür boyu görüntüleme37 ile de ölçülebilir.

Bu protokolde, endojen floresan ve SHG gibi içsel sinyalleri açıkça kullanarak dört boyutlu (4D) intravital görüntülemenin segmentasyonu için bir iş akışı, edinimden analize kadar tanımlanmıştır. Bu protokol, PDX modellerinde olduğu gibi, eksojen floresanın pratik veya mümkün olmayabileceği bir meme görüntüleme penceresinden geçen uzunlamasına çalışmalar için özellikle uygundur. Bununla birlikte, burada özetlenen segmentasyon ilkeleri, tümör biyolojisini, doku gelişimini ve hatta normal doku fizyolojisini araştıran intravital kullanıcılar için geniş çapta uygulanabilir. Bildirilen analiz yaklaşımları paketi, kullanıcıların hizalanmış veya rastgele kollajen lifi konfigürasyonlarının bölgeleri arasındaki hücresel davranışı ayırt etmelerine, tümör mikro ortamının belirli bölgelerinde bulunan hücrelerin sayılarını veya davranışlarını karşılaştırmalarına ve vaskülatürü yalnızca etiketsiz veya içsel sinyal kullanarak tümör mikro ortamına eşlemelerine olanak sağlayacaktır. Birlikte, bu yöntemler meme bezinin 4D intravital görüntülemesinden elde edilen bilgi derinliğini en üst düzeye çıkarmak için operasyonel bir çerçeve oluştururken, ek eksojen etiketlere olan ihtiyacı en aza indirir.

Protocol

Açıklanan tüm deneyler Wisconsin-Madison Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Tüm hayvan deneylerinde refah ve ağrı yönetimi her şeyden önemlidir. Bu nedenle, prosedürün her adımında hayvanın rahat ve bakımlı olduğundan emin olmak için her türlü çaba gösterilmektedir. 1. Meme görüntüleme penceresinin oluşturulması (MIW) Meme görüntüleme penceresini inşa etmek için, cerrahi sınıf…

Representative Results

MIW’nin kurulumu ve temel deneysel planlama bu süreçteki ilk adımlardır. Bu özel MIW tasarımı ve protokolü, uzunlamasına çalışmalara19 daha uygundur ve hem dik hem de ters mikroskoplarla başarıyla kullanılmıştır. Bu durumda, daha az solunum artefaktı ile meme bezinin daha fazla görüntü stabilitesine neden olduğu için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanılmıştır. Şekil 1A’da, rijit MIW’nin boyutlarını ve implantasyon işlemine grafiksel …

Discussion

4D intravital görüntüleme, doğal tümör mikroçevresinin mekansal ve zamansal bağlamındaki dinamik fizyolojik etkileşimleri araştırmak için güçlü bir araçtır. Bu makale, tümör kütlesi, bitişik stroma veya vasküler ağa yakın dinamik hücre etkileşimlerini sadece ikinci harmonik jenerasyondan veya NAD (P) H otofloresansından gelen endojen sinyalleri kullanarak bölümlere ayırmak için çok temel ve uyarlanabilir bir operasyonel çerçeve sunmaktadır. Bu protokol, görüntüleme penceresinin impl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, bu çalışmayı finanse etmek için NCI R01 CA216248, CA206458 ve CA179556 hibelerini kabul etmek istiyor. Ayrıca, Dr. Kevin Eliceiri ve görüntüleme grubuna, intravital programımızın erken gelişimindeki teknik uzmanlıkları için teşekkür ederiz. Ayrıca Dr. Ben Cox’a ve Morgridge Araştırma Enstitüsü’ndeki Eliceiri İmalat Grubu’nun diğer üyelerine, MIW’nin ilk aşamalarındaki temel teknik tasarımları için teşekkür ederiz. Dr. Ellen Dobson, ImageJ eğitilebilir WEKA segmentasyon aracı hakkında yararlı konuşmalara yardımcı oldu. Ayrıca, mikroskoplarını zamanında kullandıkları için Dr. Melissa Skala ve Dr. Alexa Barres-Heaton’a teşekkür ederiz. Son olarak, fare kullanımı ve bakımıyla ilgili tüm düşünceli tartışmalar ve tavsiyeler için Dr. Brigitte Raabe, DVM’ye teşekkür ederiz.

Materials

#1.5 12mm round cover glass Warner Instruments # 64-0712 MIW construction
1.0 mL syringe for SQ injection BD 309659 Syringe
20x objective Zeiss 421452-988 Water immersion
27G needle for SQ injection Covidien 1188827012 Needle
40x objective Nikon MRD77410 Water immersion
5-0 silk braided suture Ethicon K870 Suture for MIW implantation
Artificial tears gel Akorn NDC 59399-162-35 Eye gel
Betadine solution, 5% Fisher Scientific NC1558063 Surgery antiseptic
cotton-tipped applicator Fisher Scientific 23-400-101
Cyanoacrylate adhesive Loctite 1365882 MIW construction
fluorescent dextran Sigma T1287-50mg intravenous labelling of vasculature
forceps Mckesson.com Miltex #18-782 stainless, 4 inch, curved
GaAsP photomultiplier tube Hamamatsu 
heating blanket CARA 72 heating pad  038056000729 Temperature selectable
heating chamber home built
Fluorescent lifetime handbook Becker and Hickl https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks
inverted microscope base Nikon
Isoflurane Akorn NDC 59399-106-01 Anesthesia
Liqui-Nox Fisher Scientific 16-000-125 MIW cleaning
Meloxicam Norbrook NDC 55529-040-10 Analgesic
Micro Hose Scientific Commodities INC.  BB31695-PE/1
multiphoton scan head Bruker Ultima II Multiphoton scanhead and imaging platform
NADH FLIM filter Chroma 284994 ET 440/80 m-2P
Nair CVS 339826 Depilatory cream
objective heater Tokai Hit STRG-WELSX-SET
SHG/FAD filter Chroma 320740 ET450/40m-2P
Sparkle glass cleaner Amazon.com B00814ME24 Glass Cleaner for implanted MIW
SPC-150 photon counting board Becker and Hickl
surgical light FAJ B06XV1VQVZ Magnetic LED gooseneck light
surgical micro-scissors Excelta 366 stainless, 3 inch
Triple antibiotic ointment Actavis Pharma NDC 0472-0179-34 Antibiotic
TV catheter Custom BD 30G needle: 305106 Catheter for TV injection
Two photon filter Chroma 320282 ET585/65m-2P
two-photon laser Coherent charmeleon Tunable multiphoton laser
ultrasound gel Parker PKR-03-02 Water immersion gel
Urea crystals Sigma U5128-5G Optional: FLIM IRF
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eble, J. A., Niland, S. The extracellular matrix in tumor progression and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 36 (3), 171-198 (2019).
  2. Afik, R., et al. Tumor macrophages are pivotal constructors of tumor collagenous matrix. The Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2315-2331 (2016).
  3. Varol, C., Sagi, I. Phagocyte-extracellular matrix crosstalk empowers tumor development and dissemination. The FEBS Journal. 285 (4), 734-751 (2018).
  4. Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., Werb, Z. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis. Nature Communications. 11 (1), 5120 (2020).
  5. Han, W., et al. Oriented collagen fibers direct tumor cell intravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11208-11213 (2016).
  6. Malandrino, A., Mak, M., Kamm, R. D., Moeendarbary, E. Complex mechanics of the heterogeneous extracellular matrix in cancer. Extreme Mechanics Letters. 21, 25-34 (2018).
  7. Lugo-Cintrón, K. M., et al. Breast Fibroblasts and ECM Components Modulate Breast Cancer Cell Migration Through the Secretion of MMPs in a 3D Microfluidic Co-Culture Model. Cancers. 12 (5), 1173 (2020).
  8. Wozniak, M. A., Desai, R., Solski, P. A., Der, C. J., Keely, P. J. ROCK-generated contractility regulates breast epithelial cell differentiation in response to the physical properties of a three-dimensional collagen matrix. The Journal of Cell Biology. 163 (3), 583-595 (2003).
  9. Zhang, K., et al. The collagen receptor discoidin domain receptor 2 stabilizes SNAIL1 to facilitate breast cancer metastasis. Nature Cell Biology. 15 (6), 677-687 (2013).
  10. Malik, G., et al. Plasma fibronectin promotes lung metastasis by contributions to fibrin clots and tumor cell invasion. Cancer Research. 70 (11), 4327-4334 (2010).
  11. Bae, Y. K., Choi, J. E., Kang, S. H., Lee, S. J. Epithelial-mesenchymal transition phenotype is associated with clinicopathological factors that indicate aggressive biological behavior and poor clinical outcomes in invasive breast cancer. Journal of Breast Cancer. 18 (3), 256-263 (2015).
  12. Wei, S. C., et al. Matrix stiffness drives epithelial-mesenchymal transition and tumour metastasis through a TWIST1-G3BP2 mechanotransduction pathway. Nature Cell Biology. 17 (5), 678-688 (2015).
  13. Riching, K. M., et al. 3D collagen alignment limits protrusions to enhance breast cancer cell persistence. Biophysical Journal. 107 (11), 2546-2558 (2014).
  14. Carey, S. P., et al. Local extracellular matrix alignment directs cellular protrusion dynamics and migration through Rac1 and FAK. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 8 (8), 821-835 (2016).
  15. Ray, A., Morford, R. K., Ghaderi, N., Odde, D. J., Provenzano, P. P. Dynamics of 3D carcinoma cell invasion into aligned collagen. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 10 (2), 100-112 (2018).
  16. Szulczewski, J. M., et al. Directional cues in the tumor microenvironment due to cell contraction against aligned collagen fibers. Acta Biomaterialia. 129, 96-109 (2021).
  17. Esbona, K., et al. The Presence of Cyclooxygenase 2, Tumor-Associated Macrophages, and Collagen Alignment as Prognostic Markers for Invasive Breast Carcinoma Patients. The American Journal of Pathology. 188 (3), 559-573 (2018).
  18. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  19. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  20. Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).
  21. Boone, P. G., et al. A cancer rainbow mouse for visualizing the functional genomics of oncogenic clonal expansion. Nature Communications. 10 (1), 5490 (2019).
  22. Dawson, C. A., Mueller, S. N., Lindeman, G. J., Rios, A. C., Visvader, J. E. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nature Protocols. 16 (4), 1907-1935 (2021).
  23. Leung, E., et al. Blood vessel endothelium-directed tumor cell streaming in breast tumors requires the HGF/C-Met signaling pathway. Oncogene. 36 (19), 2680-2692 (2017).
  24. Jain, R. K. Normalizing tumor microenvironment to treat cancer: Bench to bedside to biomarkers. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of The American Society of Clinical Oncology. 31 (17), 2205-2218 (2013).
  25. Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Research. 67 (6), 2649-2656 (2007).
  26. Baklaushev, V. P., et al. Modeling and integral X-ray, optical, and MRI visualization of multiorgan metastases of orthotopic 4T1 breast carcinoma in BALB/c Mice. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 158 (4), 581-588 (2015).
  27. Baklaushev, V. P., et al. Luciferase Expression Allows Bioluminescence Imaging But Imposes Limitations on the Orthotopic Mouse (4T1) Model of Breast Cancer. Scientific Reports. 7 (1), 7715 (2017).
  28. Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).
  29. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 16007 (2014).
  30. Liu, Y., et al. Fibrillar Collagen Quantification With Curvelet Transform Based Computational Methods. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 198 (2020).
  31. Püspöki, Z., Storath, M., Sage, D., Unser, M. Transforms and Operators for Directional Bioimage Analysis: A Survey. Advances in Anatomy, Embryology, and Cell Biology. 219, 69-93 (2016).
  32. Saytashev, I., et al. Multiphoton excited hemoglobin fluorescence and third harmonic generation for non-invasive microscopy of stored blood. Biomedical Optics Express. 7 (9), 3449-3460 (2016).
  33. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
  34. von Au, A., et al. Circulating fibronectin controls tumor growth. Neoplasia. 15 (8), 925-938 (2013).
  35. Murgai, M., et al. KLF4-dependent perivascular cell plasticity mediates pre-metastatic niche formation and metastasis. Nature Medicine. 23 (10), 1176-1190 (2017).
  36. You, S., et al. Intravital imaging by simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy. Nature Communications. 9 (1), 2125 (2018).
  37. Yakimov, B. P., et al. Label-free characterization of white blood cells using fluorescence lifetime imaging and flow-cytometry: molecular heterogeneity and erythrophagocytosis. Biomedical Optics Express. 10 (8), 4220-4236 (2019).
  38. Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
  39. Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
  40. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4 (1), 38 (2006).
  41. Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1221-1232 (2011).
  42. Szulczewski, J. M., et al. In Vivo Visualization of Stromal Macrophages via label-free FLIM-based metabolite imaging. Scientific Reports. 6, 25086 (2016).
  43. Hoffmann, E. J., Ponik, S. M. Biomechanical Contributions to Macrophage Activation in the Tumor Microenvironment. Frontiers in Oncology. 10, 787 (2020).
  44. Pakshir, P., et al. Dynamic fibroblast contractions attract remote macrophages in fibrillar collagen matrix. Nature Communications. 10 (1), 1850 (2019).
  45. Dobrolecki, L. E., et al. Patient-derived xenograft (PDX) models in basic and translational breast cancer research. Cancer and Metastasis Reviews. 35 (4), 547-573 (2016).
  46. Shirshin, E. A., et al. Two-photon autofluorescence lifetime imaging of human skin papillary dermis in vivo: assessment of blood capillaries and structural proteins localization. Scientific Reports. 7 (1), 1171 (2017).
  47. Weigert, M., et al. Content-aware image restoration: pushing the limits of fluorescence microscopy. Nature Methods. 15 (12), 1090-1097 (2018).

Tags

Keywords: Intravital ImagingMammary Tumor MicroenvironmentLabel-free SegmentationCollagen FibersAutofluorescent MetabolitesExtracellular MatrixVascular StructuresMammary Imaging WindowSurgical ProcedureMouse
check_url/63413?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Burkel, B. M., Inman, D. R., Virumbrales-Muñoz, M., Hoffmann, E. J., Ponik, S. M. A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment. J. Vis. Exp. (183), e63413, doi:10.3791/63413 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image