유방 종양 미세환경의 생체 내 이미징을 위한 라벨 없는 세분화 접근법
Summary
여기에 설명된 생체내 영상화 방법은 대사 보조인자 NAD(P)H로부터의 콜라겐 초고조파 생성 및 내인성 형광을 이용하여 표지되지 않은 종양 미세환경을 종양, 기질 및 혈관 구획으로 비침습적으로 분절하여 4D 생체내 영상의 심층 분석을 한다.
Abstract
살아있는 종양 미세환경 내에서 수많은 세포 유형과 세포외 매트릭스(ECM) 사이의 복잡하고 역동적인 생리적 상호작용을 시각화하는 능력은 종양 진행을 조절하는 기전을 이해하는 중요한 단계이다. 이것은 현재의 생체 내 이미징 기술을 통해 달성 될 수 있지만, 조직의 이질적 특성과 실험 관찰 내에서 공간 맥락에 대한 필요성으로 인해 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다. 이를 위해 우리는 콜라겐 초고조파 생성 영상화, 대사 보조인자 NAD(P)H로부터의 내인성 형광, 형광 수명 이미징 현미경(FLIM)을 비침습적으로 종양 미세환경을 종양 둥지의 기본 도메인, 주변 스트로마 또는 ECM 및 혈관 구조로 분류하는 수단으로 쌍을 이루는 생체내 이미징 워크플로우를 개발했습니다. 이 비침습적 프로토콜은 유방 종양 모델의 타임랩스 이미지 획득부터 후처리 분석 및 이미지 세분화에 이르기까지 단계별 프로세스를 자세히 설명합니다. 이 워크플로우의 주요 장점은 대사 시그니처를 활용하여 외인성 형광 라벨을 사용하지 않고 동적으로 변화하는 살아있는 종양 미세환경을 맥락화하여 인간 환자 유래 이종이식편(PDX) 모델 및 외인성 형광단이 쉽게 적용되지 않는 미래의 임상 사용에 유리하다는 것입니다.
Introduction
종양 미세환경 내의 세포외 기질 (ECM)은 질환 진행을 더욱 촉진하기 위해 다수의 세포 유형에 의해 동적으로 침착되고 리모델링되는 것으로 알려져 있다 1,2,3. 이러한 매트릭스 변경은 세포 거동을 변화시키는 기계적 및 생물학적 단서를 모두 제공하며 종종 매트릭스 리모델링의 지속적인 사이클을 초래합니다 4. 종양 세포와 세포외 매트릭스 사이의 동적, 상호적 상호 작용에 대한 조사는 종종 시험관내 배양 또는 미세유체 시스템에서 3차원(3D)을 사용하여 수행된다. 이러한 상향식 접근법은 ECM 리모델링5,6,7, 증식 증가8, 상피에서 중간엽 전이9,10,11,12, 종양 세포 이동 및 침윤 7,13,14,15,16 의 메카니즘을 입증하는 반면, 그들의 초점은 생리학적 조직 내에 존재하는 상호작용의 다양성 및 이질성과 비교하여 동질적인 3D 매트릭스 내의 몇몇 세포 유형 (예를 들어, 종양 세포 또는 섬유아세포)에 주로 집중되어 왔다. 시험관내 시스템 이외에도, 생체외 종양 조직학은 또한 이러한 세포-세포 및 세포-ECM 상호작용(17)에 대한 약간의 통찰을 제공할 수 있다. 면역조직화학은 ECM의 공간적으로 불균질한 조성 및 구조에 대하여 여러 세포 유형을 분석할 수 있다는 장점이 있지만, 고정된 조직의 정적 종점은 세포와 미세환경 사이의 상호작용의 동적 성질을 포착하지 못한다. Intravital 이미징은 네이티브 종양 미세 환경의 생리적 맥락 내에서 다양하고 역동적 인 상호 작용을 조사하는 문을 열었습니다.
생명 내 종양 영상의 기능은 빠르게 발전하고 있습니다. 창문을 이식하기 위한 이미징 윈도우 및 수술 기술의 설계의 개선은 다양한 해부학적 위치(즉, 원발성 종양, 림프절, 전이성 부위18,19,20)에서 장기 종방향 종양 영상화를 가능하게 하였다. 더욱이, 다중 차원(즉, 분광, 공간 형광 강도 및 수명) 및 고해상도 및 속도(비디오 속도)로 데이터를 시각화하고 수집하는 광학 계측의 용량은 널리 접근이 가능해지고 있다. 개선된 기술은 생리학적 환경 내에서 세포 신호전달 및 표현형 역학의 급격한 변화를 탐구할 수 있는 기회를 제공한다. 마지막으로, 광유전학적 도구 및 광범위한 유전자 형광 구축물의 확장은 발달 또는 질병 진행 동안 종양 미세환경 또는 세포 계보 추적에서 세포 이동을 포획하기 위해 특정 세포 유형의 태깅을 허용한다(21,22). CRISPR / Cas9 기술과 함께 이러한 도구를 사용하면 연구원이시기 적절하게 고유 한 동물 모델을 생성 할 수있는 기회를 얻을 수 있습니다.
이러한 모든 진보가 생체 내 이미징을 역동적이고 생리적 인 세포 상호 작용을 탐구하는 점점 더 강력한 방법으로 만드는 반면, 조직 수준에서 공간적, 시간적, 구조적 맥락을 이러한 생물학적 상호 작용에 제공하는 전략을 개발하는 것이 여전히 중요합니다. 현재, 많은 생명 내 영상 연구는 형광 염료를 혈관구조에 주입하거나 물리적 특징을 묘사하기 위해 형광 단백질을 외인성으로 발현하는 마우스 모델을 사용하여 혈관과 같은 시각적 랜드 마크의 부족을 보완합니다. 주사용 염료 및 형광 덱스트란과 같은 기질은 활력 내 콜렉션19, 23, 24에서 혈관구조를 성공적으로 표지하기 위해 광범위하게 활용된다. 그러나, 이러한 접근법은 제한이 없는 것은 아니다. 하나는 추가 마우스 조작이 필요하며 그 유용성은 단기 실험으로 제한됩니다. 종단 연구의 경우, 형광 덱스트란은 식세포 세포에서 덱스트란의 축적 또는 시간25에 따른 주변 조직으로의 확산을 관찰 할 때 문제가 될 수 있습니다. 마우스 모델로의 외인성 형광 단백질 혼입은 형광 덱스트란에 대한 대안으로서 제시되어 왔지만 그 자체의 한계를 제시한다. 마우스 모델 내에서 외인성 형광단의 가용성과 다양성은 여전히 제한적이며 만드는 데 비용이 많이 듭니다. 추가적으로, PDX 모델과 같은 특정 모델에서, 유전자 조작은 바람직하지 않거나 가능하지 않다. 또한, 세포 내 형광 또는 생체발광 단백질의 존재는 마우스 내 및 면역적격 마우스 모델 내에서 외래로 인식되며, 이것은 숙주 면역계(26,27)의 반응으로 인한 전이의 양을 감소시킨다는 것이 밝혀졌다. 마지막으로, 공간적 맥락 또는 후속 데이터를 분절하기 위해 사용되는 외인성 형광 단백질 또는 형광 염료는 종종 관심의 생리학적 상호작용을 조사하는데 달리 사용될 수 있는 광 스펙트럼의 프라임 범위를 차지한다.
ECM으로부터의 내재적 신호 또는 조직 내 세포로부터의 내인성 형광의 사용은 보다 심층적인 세포 및 공간 분석을 위해 생체내 데이터를 분절하는 잠재적인 범용 라벨 프리 수단을 나타낸다. 제2고조파 생성(SHG)은 ECM(28)을 시각화하는데 오랫동안 사용되어 왔다. 섬유 조직 29,30,31의 특성화를 돕기 위한 중요한 도구의 후속 개발로, 국소 ECM 구조에 비해 세포 거동을 특성화할 수 있다. 또한, 내인성 대사산물인 NAD(P)H로부터의 자가형광은 생체내에서 종양 미세환경을 구획화하는 또 다른 표지가 없는 도구를 제공한다. NAD(P)H는 종양 세포에서 밝게 형광을 띠며, 성장하는 종양 둥지의 경계를 그의 주변 스트로마21,32로부터 구별하는데 사용될 수 있다. 마지막으로, 혈관구조는 종양 미세환경 및 주요 세포형-특이적 상호작용의 부위에서 중요한 생리학적 구조이다(33,34,35). 적혈구(RBC) 또는 혈장의 여기가 종양 혈관조직을 시각화하는데 사용되어 왔으며, 2- 또는 3-광자 여기(2P; 3P)를 사용하여 혈류 속도의 측정이 가능한 것으로 나타났다(36). 그러나 더 큰 혈관은 내인성 형광 서명으로 쉽게 식별 할 수 있지만 미묘하고 가변적이며 형광이 적은 작은 혈관을 식별하려면 더 많은 전문 지식이 필요합니다. 이러한 내재적 인 어려움은 최적의 이미지 세분화를 방해합니다. 다행스럽게도, 내인성 형광의 이들 공급원(즉, 적혈구 및 혈장)은 또한 형광 수명 이미징(37)에 의해 측정될 수 있으며, 이는 혈관구조의 독특한 광물리적 특성을 이용하고 성장하는 생체내 툴박스에 유용한 부가물을 나타낸다.
이 프로토콜에서는 내인성 형광 및 SHG와 같은 고유 신호를 사용하여 명시 적으로 4 차원 (4D) 생체 내 이미징의 세분화를위한 워크 플로우가 획득에서 분석까지 설명됩니다. 이 프로토콜은 PDX 모델의 경우와 같이 외인성 형광이 실용적이거나 가능하지 않을 수 있는 유방 이미징 창을 통한 종단 연구에 특히 적합합니다. 그러나 여기에 설명 된 세분화 원칙은 종양 생물학, 조직 발달 또는 정상 조직 생리학을 조사하는 생체 내 사용자에게 광범위하게 적용됩니다. 보고된 분석 접근법 모음을 통해 사용자는 정렬된 또는 무작위 콜라겐 섬유 구성의 영역 간에 세포 거동을 구별하고, 종양 미세환경의 특정 영역에 상주하는 세포의 수 또는 거동을 비교하고, 라벨이 없거나 내재적 신호만을 사용하여 혈관을 종양 미세환경에 매핑할 수 있습니다. 함께, 이러한 방법은 유선의 4D 생체 내 이미징에서 얻은 정보의 깊이를 극대화하는 동시에 추가적인 외인성 라벨의 필요성을 최소화하기위한 운영 프레임 워크를 만듭니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
4D 생체 내 영상화는 천연 종양 미세환경의 공간적 및 시간적 맥락 내에서 역동적인 생리학적 상호작용을 조사하는 강력한 도구이다. 이 원고는 종양 질량, 인접한 스트로마 또는 두 번째 고조파 생성 또는 NAD(P)H 자가형광으로부터의 내인성 신호만을 사용하여 혈관 네트워크에 근접한 내에서 동적 세포 상호작용을 구획화하는 매우 기본적이고 적응 가능한 작동 프레임워크를 제공한다. 이 프로토?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는이 작업에 대한 NCI R01 CA216248, CA206458 및 CA179556 보조금을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한 Kevin Eliceiri 박사와 그의 이미징 그룹이 우리의 intravital 프로그램의 초기 개발에 대한 기술적 전문성을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한 벤 콕스 박사와 Morgridge Institute for Research의 Eliceiri Fabrication Group의 다른 회원들에게 MIW의 초기 단계에서 필수적인 기술 설계에 감사드립니다. Ellen Dobson 박사는 ImageJ 교육 가능한 WEKA 세분화 도구에 대한 유용한 대화를 도왔습니다. 또한 현미경을 적시에 사용해 주신 Melissa Skala 박사와 Alexa Barres-Heaton 박사에게 감사드립니다. 마지막으로, 우리는 마우스 취급 및 관리에 대한 모든 사려 깊은 토론과 조언에 대해 Brigitte Raabe, D.V.M 박사에게 감사드립니다.
Materials
| #1.5 12mm round cover glass | Warner Instruments | # 64-0712 | MIW construction |
| 1.0 mL syringe for SQ injection | BD | 309659 | Syringe |
| 20x objective | Zeiss | 421452-988 | Water immersion |
| 27G needle for SQ injection | Covidien | 1188827012 | Needle |
| 40x objective | Nikon | MRD77410 | Water immersion |
| 5-0 silk braided suture | Ethicon | K870 | Suture for MIW implantation |
| Artificial tears gel | Akorn | NDC 59399-162-35 | Eye gel |
| Betadine solution, 5% | Fisher Scientific | NC1558063 | Surgery antiseptic |
| cotton-tipped applicator | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 1365882 | MIW construction |
| fluorescent dextran | Sigma | T1287-50mg | intravenous labelling of vasculature |
| forceps | Mckesson.com | Miltex #18-782 | stainless, 4 inch, curved |
| GaAsP photomultiplier tube | Hamamatsu | ||
| heating blanket | CARA 72 heating pad | 038056000729 | Temperature selectable |
| heating chamber | home built | ||
| Fluorescent lifetime handbook | Becker and Hickl | https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks | |
| inverted microscope base | Nikon | ||
| Isoflurane | Akorn | NDC 59399-106-01 | Anesthesia |
| Liqui-Nox | Fisher Scientific | 16-000-125 | MIW cleaning |
| Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | Analgesic |
| Micro Hose | Scientific Commodities INC. | BB31695-PE/1 | |
| multiphoton scan head | Bruker Ultima II | Multiphoton scanhead and imaging platform | |
| NADH FLIM filter | Chroma | 284994 | ET 440/80 m-2P |
| Nair | CVS | 339826 | Depilatory cream |
| objective heater | Tokai Hit | STRG-WELSX-SET | |
| SHG/FAD filter | Chroma | 320740 | ET450/40m-2P |
| Sparkle glass cleaner | Amazon.com | B00814ME24 | Glass Cleaner for implanted MIW |
| SPC-150 photon counting board | Becker and Hickl | ||
| surgical light | FAJ | B06XV1VQVZ | Magnetic LED gooseneck light |
| surgical micro-scissors | Excelta | 366 | stainless, 3 inch |
| Triple antibiotic ointment | Actavis Pharma | NDC 0472-0179-34 | Antibiotic |
| TV catheter | Custom | BD 30G needle: 305106 | Catheter for TV injection |
| Two photon filter | Chroma | 320282 | ET585/65m-2P |
| two-photon laser | Coherent charmeleon | Tunable multiphoton laser | |
| ultrasound gel | Parker | PKR-03-02 | Water immersion gel |
| Urea crystals | Sigma | U5128-5G | Optional: FLIM IRF |
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