En etikettfri segmenteringstilnærming for intravital avbildning av mammary tumormikromiljø

Summary

Den intravitale avbildningsmetoden som er beskrevet her, bruker kollagen andre harmoniske generasjon og endogen fluorescens fra den metabolske kofaktoren NAD (P)H til ikke-invasivt segmentere et umerket tumormikromiljø i tumor-, stromal- og vaskulære rom for grundig analyse av 4D intravitale bilder.

Abstract

Evnen til å visualisere komplekse og dynamiske fysiologiske interaksjoner mellom mange celletyper og den ekstracellulære matrisen (ECM) i et levende tumormikromiljø er et viktig skritt mot å forstå mekanismer som regulerer tumorprogresjon. Selv om dette kan oppnås gjennom dagens intravitale avbildningsteknikker, er det fortsatt utfordrende på grunn av vevets heterogene natur og behovet for romlig kontekst innenfor den eksperimentelle observasjonen. For dette formål har vi utviklet en intravital bildearbeidsflyt som kombinerer kollagen andre harmoniske generasjonsavbildning, endogen fluorescens fra den metabolske kofaktoren NAD (P)H, og fluorescens levetidsavbildningsmikroskopi (FLIM) som et middel til ikke-invasivt å dele opp tumormikromiljøet i grunnleggende domener av tumorreiret, den omkringliggende stroma eller ECM, og vaskulaturen. Denne ikke-invasive protokollen beskriver den trinnvise prosessen som spenner fra oppkjøp av tidsforløpbilder av mammary tumormodeller til etterbehandlingsanalyse og bildesegmentering. Den viktigste fordelen med denne arbeidsflyten er at den utnytter metabolske signaturer for å kontekstualisere det dynamisk skiftende levende tumormikromiljøet uten bruk av eksogene fluorescerende etiketter, noe som gjør det fordelaktig for humane pasientavledede xenograft (PDX) modeller og fremtidig klinisk bruk der ekstrinsiske fluoroforer ikke er lett anvendelige.

Introduction

Den ekstracellulære matrisen (ECM) i tumormikromiljøet er kjent for å bli dynamisk avsatt og ombygd av flere celletyper for ytterligere å lette sykdomsprogresjonen ^1,2,3. Disse matriseendringene gir både mekaniske og biologiske signaler som endrer celleadferd og ofte resulterer i en kontinuerlig syklus av matriseoppussing⁴. Undersøkelse av det dynamiske, gjensidige samspillet mellom tumorceller og den ekstracellulære matrisen utføres ofte ved hjelp av tredimensjonal (3D) in vitrokultur eller mikrofluidiske systemer. Mens disse nedenfra-og-opp-tilnærmingene har demonstrert mekanismer for ECM-ombygging ^5,6,7, økt spredning⁸, epitelial til mesenchymal overgang ^9,10,11,12, og tumorcellemigrasjon og invasjon ^{7,13,14,15,16} , har deres fokus primært vært på noen få celletyper (f.eks. tumorceller eller fibroblaster) innenfor en homogen 3D-matrise sammenlignet med mangfoldet og heterogeniteten til interaksjoner som finnes i et fysiologisk vev. I tillegg til in vitro-systemer kan ex vivo tumor histologi også gi litt innsikt i disse cellecelle- og celle-ECM-interaksjonene¹⁷. Immunohistokjemi har fordelen av å kunne analysere flere celletyper med hensyn til den romlig heterogene sammensetningen og arkitekturen til ECM, men de statiske endepunktene i fast vev fanger ikke opp den dynamiske naturen til interaksjoner mellom celler og mikromiljøet. Intravital avbildning har åpnet døren for å forhøre ulike og dynamiske interaksjoner innenfor den fysiologiske konteksten til det opprinnelige tumormikromiljøet.

Evnen til intravital tumoravbildning utvikler seg raskt. Forbedringer i utformingen av bildevinduer og kirurgiske teknikker for å implantere vinduene har gjort det mulig med langvarig langsgående tumoravbildning på en rekke anatomiske steder (dvs. primærsvulst, lymfeknuter, metastatiske steder 18,19,20). Dessuten blir kapasiteten til optisk instrumentering til å visualisere og samle inn data i flere dimensjoner (dvs. spektral, romlig fluorescensintensitet og levetid), og med høy oppløsning og hastighet (videohastighet) allment tilgjengelig. Den forbedrede teknologien gir en mulighet til å utforske raske endringer i cellesignalering og fenotypisk dynamikk i et fysiologisk miljø. Til slutt tillater utvidelsen av optogenetiske verktøy og det brede spekteret av genetiske fluorescerende konstruksjoner tagging av spesifikke celletyper for å fange cellemigrasjon i tumormikromiljøet eller cellelinjesporing under utvikling eller sykdomsprogresjon ^21,22. Bruken av disse verktøyene i kombinasjon med CRISPR/Cas9-teknologi gir forskerne mulighet til å generere unike dyremodeller i tide.

Mens alle disse fremskrittene gjør intravital avbildning til en stadig kraftigere metode for å utforske dynamiske og fysiologiske cellulære interaksjoner, er det fortsatt et viktig behov for å utvikle strategier som gir romlig, tidsmessig og strukturell kontekst på vevsnivå til disse biologiske interaksjonene. For tiden kompenserer mange intravitale avbildningsstudier for mangel på visuelle landemerker som blodkar ved å injisere fluorescerende fargestoffer i vaskulaturen eller bruke musemodeller som eksogent uttrykker fluorescerende proteiner for å avgrense fysiske egenskaper. Injiserbare fargestoffer og substrater som fluorescerende dextrans brukes i stor grad til å merke vaskulaturen i intravitale samlinger^{19, 23, 24}. Denne tilnærmingen er imidlertid ikke uten begrensninger. For det første krever det ytterligere musemanipulasjoner, og verktøyet er begrenset til kortsiktige eksperimenter. For langsgående studier kan fluorescerende dextran være problematisk når vi observerer opphopning av dekstran i fagocytiske celler eller diffusjon i det omkringliggende vevet over tid²⁵. Eksogen fluorescerende protein inkorporering i musemodellen har blitt presentert som et alternativ til fluorescerende dextrans, men presenterer begrensninger av seg selv. Tilgjengeligheten og mangfoldet av eksogene fluoroforer i musemodeller er fortsatt begrenset og dyrt å lage. I tillegg, i spesifikke modeller, for eksempel PDX-modeller, er genetiske manipulasjoner ikke ønskelige eller mulige. Det har også vist seg at tilstedeværelsen av fluorescerende eller bioluminescerende proteiner i celler er anerkjent som fremmed i musen, og innenfor immunkompetente musemodeller reduserer dette mengden metastase på grunn av responsen fra vertsimmunsystemet^26,27. Til slutt opptar eksogene fluorescerende proteiner eller fluorescerende fargestoffer som brukes til romlig kontekst eller for å segmentere etterfølgende data ofte hovedområder i lysspekteret som ellers kunne brukes til å undersøke de fysiologiske interaksjonene av interesse.

Bruken av det iboende signalet fra ECM eller endogen fluorescens fra celler i vevet representerer et potensielt universelt etikettfritt middel for å segmentere intravitale data for mer dyptgående cellulær og romlig analyse. Andre harmoniske generasjon (SHG) har lenge vært brukt til å visualisere ECM²⁸. Med den påfølgende utviklingen av viktige verktøy for å hjelpe til med karakteriseringen av fiberorganisasjon 29,30,31, er det mulig å karakterisere celleadferd i forhold til lokal ECM-struktur. I tillegg gir autofluorescence fra den endogene metabolitten, NAD (P)H, et annet etikettfritt verktøy for å dele opp tumormikromiljøet in vivo. NAD(P)H fluoresces sterkt i tumorceller og kan brukes til å diskriminere grensene til den voksende svulstreiret fra sin omkringliggende stroma ^21,32. Til slutt er vaskulaturen en viktig fysiologisk struktur i tumormikromiljøet og stedet for nøkkelcellespesifikke interaksjoner 33,34,35. Eksitasjonen av røde blodlegemer (RBC) eller blodplasma har blitt brukt til å visualisere tumorvaskulaturen, og ved hjelp av to- eller trefotoneksitasjon (2P; 3P) har målingen av blodstrømshastigheter vist seg å være mulig³⁶. Men mens større blodårer er lett identifiserbare ved deres endogene fluorescenssignaturer, krever identifisering av subtile, variable og mindre fluorescerende små blodkar mer kompetanse. Disse iboende vanskelighetene hindrer optimal bildesegmentering. Heldigvis kan disse kildene til endogen fluorescens (dvs. røde blodlegemer og blodplasma) også måles ved fluorescens levetidsavbildning³⁷, som utnytter de unike fotofysiske egenskapene til vaskulaturen og representerer et nyttig tillegg til den voksende intravitale verktøykassen.

I denne protokollen beskrives en arbeidsflyt for segmentering av firedimensjonal (4D) intravital avbildning eksplisitt ved hjelp av iboende signaler som endogen fluorescens og SHG fra oppkjøp til analyse. Denne protokollen er spesielt relevant for langsgående studier gjennom et pattedyravbildningsvindu der eksogen fluorescens kanskje ikke er praktisk eller mulig, slik tilfellet er med PDX-modeller. Segmenteringsprinsippene som er skissert her, gjelder imidlertid bredt for intravitale brukere som undersøker tumorbiologi, vevsutvikling eller til og med normal vevsfysiologi. Den rapporterte pakken med analysetilnærminger vil tillate brukerne å skille cellulær oppførsel mellom regioner med justerte eller tilfeldige kollagenfiberkonfigurasjoner, sammenligne tall eller oppførsel av celler som bor i bestemte områder av tumormikromiljøet, og kartlegge vaskulaturen til tumormikromiljøet ved hjelp av bare etikettfritt eller iboende signal. Sammen skaper disse metodene et operativt rammeverk for å maksimere dybden av informasjon oppnådd fra 4D intravital avbildning av brystkjertelen samtidig som behovet for ekstra eksogene etiketter minimeres.

Protocol

Alle beskrevne eksperimenter ble godkjent av University of Wisconsin-Madison’s Institutional Animal Care and Use Committee. Trivsel og smertebehandling i alle dyreforsøk er avgjørende. Dermed er det gjort alt for å sikre at dyret er komfortabelt og godt ivaretatt på hvert trinn i prosedyren. 1. Generering av pattedyr bildevinduet (MIW) For å konstruere pattedyrets bildevindu, lag en 14 mm ring fra kirurgisk rustfritt stål. Rengjør den bearbeidede vin…

Representative Results

Installasjonen av MIW og grunnleggende eksperimentell planlegging er de første trinnene i denne prosessen. Denne spesielle MIW-designen og protokollen er mer egnet til langsgående studier19 og har blitt brukt med både oppreiste og inverterte mikroskoper. I dette tilfellet ble et invertert mikroskop brukt, da det har resultert i større bildestabilitet av brystkjertelen med færre pusteartefakter. I figur 1A gir vi dimensjonene til den stive MIW og en grafisk oversi…

Discussion

4D intravital avbildning er et kraftig verktøy for å undersøke dynamiske fysiologiske interaksjoner innenfor den romlige og tidsmessige konteksten til det opprinnelige tumormikromiljøet. Dette manuskriptet gir et veldig grunnleggende og tilpasningsdyktig operasjonelt rammeverk for å dele opp dynamiske celleinteraksjoner i tumormassen, det tilstøtende stromaet, eller i nærheten av det vaskulære nettverket ved hjelp av bare endogene signaler fra andre harmoniske generasjon eller NAD (P) H autofluorescence. Denne pr…

Materials

#1.5 12mm round cover glass	Warner Instruments	# 64-0712	MIW construction
1.0 mL syringe for SQ injection	BD	309659	Syringe
20x objective	Zeiss	421452-988	Water immersion
27G needle for SQ injection	Covidien	1188827012	Needle
40x objective	Nikon	MRD77410	Water immersion
5-0 silk braided suture	Ethicon	K870	Suture for MIW implantation
Artificial tears gel	Akorn	NDC 59399-162-35	Eye gel
Betadine solution, 5%	Fisher Scientific	NC1558063	Surgery antiseptic
cotton-tipped applicator	Fisher Scientific	23-400-101
Cyanoacrylate adhesive	Loctite	1365882	MIW construction
fluorescent dextran	Sigma	T1287-50mg	intravenous labelling of vasculature
forceps	Mckesson.com	Miltex #18-782	stainless, 4 inch, curved
GaAsP photomultiplier tube	Hamamatsu
heating blanket	CARA 72 heating pad	038056000729	Temperature selectable
heating chamber	home built
Fluorescent lifetime handbook	Becker and Hickl		https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks
inverted microscope base	Nikon
Isoflurane	Akorn	NDC 59399-106-01	Anesthesia
Liqui-Nox	Fisher Scientific	16-000-125	MIW cleaning
Meloxicam	Norbrook	NDC 55529-040-10	Analgesic
Micro Hose	Scientific Commodities INC.	BB31695-PE/1
multiphoton scan head	Bruker Ultima II		Multiphoton scanhead and imaging platform
NADH FLIM filter	Chroma	284994	ET 440/80 m-2P
Nair	CVS	339826	Depilatory cream
objective heater	Tokai Hit	STRG-WELSX-SET
SHG/FAD filter	Chroma	320740	ET450/40m-2P
Sparkle glass cleaner	Amazon.com	B00814ME24	Glass Cleaner for implanted MIW
SPC-150 photon counting board	Becker and Hickl
surgical light	FAJ	B06XV1VQVZ	Magnetic LED gooseneck light
surgical micro-scissors	Excelta	366	stainless, 3 inch
Triple antibiotic ointment	Actavis Pharma	NDC 0472-0179-34	Antibiotic
TV catheter	Custom	BD 30G needle: 305106	Catheter for TV injection
Two photon filter	Chroma	320282	ET585/65m-2P
two-photon laser	Coherent charmeleon		Tunable multiphoton laser
ultrasound gel	Parker	PKR-03-02	Water immersion gel
Urea crystals	Sigma	U5128-5G	Optional: FLIM IRF