Den intravitala avbildningsmetoden som beskrivs här använder kollagen andra harmoniska generationen och endogen fluorescens från den metaboliska samfaktorn NAD (P) H för att icke-invasivt segmentera en omärkt tumörmikromiljö i tumör-, stromala och vaskulära fack för djupgående analys av 4D-intravitala bilder.
Förmågan att visualisera komplexa och dynamiska fysiologiska interaktioner mellan många celltyper och den extracellulära matrisen (ECM) inom en levande tumörmikromiljö är ett viktigt steg mot att förstå mekanismer som reglerar tumörprogression. Även om detta kan åstadkommas genom nuvarande intravitala avbildningstekniker, är det fortfarande utmanande på grund av vävnadernas heterogena natur och behovet av rumsligt sammanhang inom den experimentella observationen. För detta ändamål har vi utvecklat ett intravitalt bildarbetsflöde som parar kollagen andra harmoniska generationens bildbehandling, endogen fluorescens från den metaboliska samfaktorn NAD (P) H och fluorescens livstidsavbildningsmikroskopi (FLIM) som ett sätt att icke-invasivt dela upp tumörmikromiljön i grundläggande domäner i tumörboet, den omgivande stroma eller ECM och vaskulaturen. Detta icke-invasiva protokoll beskriver steg-för-steg-processen som sträcker sig från förvärv av time-lapse-bilder av brösttumörmodeller till efterbehandlingsanalys och bildsegmentering. Den främsta fördelen med detta arbetsflöde är att det utnyttjar metaboliska signaturer för att kontextualisera den dynamiskt föränderliga levande tumörmikromiljön utan användning av exogena fluorescerande etiketter, vilket gör det fördelaktigt för humana patient-härledda xenograftmodeller (PDX) och framtida klinisk användning där yttre fluoroforer inte är lätt tillämpliga.
Den extracellulära matrisen (ECM) i tumörmikromiljön är känd för att vara dynamiskt deponerad och ombyggd av flera celltyper för att ytterligare underlätta sjukdomsprogression 1,2,3. Dessa matrisförändringar ger både mekaniska och biologiska signaler som förändrar cellbeteendet och resulterar ofta i en fortsatt cykel av matrisombyggnad4. Undersökning av det dynamiska, ömsesidiga samspelet mellan tumörceller och den extracellulära matrisen utförs ofta med hjälp av tredimensionell (3D) in vitro-odling eller mikrofluidiska system. Medan dessa bottom-up-metoder har visat mekanismer för ECM-ombyggnad 5,6,7, ökad proliferation8, epitel till mesenkymal övergång 9,10,11,12 och tumörcellmigration och invasion 7,13,14,15,16 har deras fokus främst legat på ett fåtal celltyper (t.ex. tumörceller eller fibroblaster) inom en homogen 3D-matris jämfört med mångfalden och heterogeniteten hos interaktioner som finns i en fysiologisk vävnad. Förutom in vitro-system kan ex vivo tumör histologi också ge viss inblick i dessa cell-cell- och cell-ECM-interaktioner17. Immunohistokemi har fördelen att kunna analysera flera celltyper med avseende på ECM: s rumsligt heterogena sammansättning och arkitektur, men de statiska slutpunkterna för fast vävnad fångar inte den dynamiska karaktären av interaktioner mellan celler och mikromiljön. Intravital avbildning har öppnat dörren för att förhöra olika och dynamiska interaktioner inom det fysiologiska sammanhanget för den inhemska tumörmikromiljön.
Kapaciteten hos intravital tumöravbildning utvecklas snabbt. Förbättringar i utformningen av bildfönster och kirurgiska tekniker för att implantera fönstren har möjliggjort långsiktig longitudinell tumöravbildning på en mängd olika anatomiska platser (dvs. primär tumör, lymfkörtlar, metastatiska platser 18,19,20). Dessutom blir kapaciteten hos optisk instrumentering att visualisera och samla in data i flera dimensioner (dvs. spektral, rumslig fluorescensintensitet och livslängd) och vid hög upplösning och hastighet (videohastighet) allmänt tillgänglig. Den förbättrade tekniken ger en möjlighet att utforska snabba förändringar i cellsignalering och fenotypisk dynamik inom en fysiologisk miljö. Slutligen möjliggör expansionen av optogenetiska verktyg och det stora utbudet av genetiska fluorescerande konstruktioner märkning av specifika celltyper för att fånga cellmigration i tumörmikromiljön eller cellspårning under utveckling eller sjukdomsprogression 21,22. Användningen av dessa verktyg i kombination med CRISPR/Cas9-teknik ger forskare möjlighet att generera unika djurmodeller i tid.
Medan alla dessa framsteg gör intravital avbildning till en allt kraftfullare metod för att utforska dynamiska och fysiologiska cellulära interaktioner, finns det fortfarande ett viktigt behov av att utveckla strategier som ger rumsligt, tidsmässigt och strukturellt sammanhang på vävnadsnivå till dessa biologiska interaktioner. För närvarande kompenserar många intravitala avbildningsstudier för bristen på visuella landmärken som blodkärl genom att injicera fluorescerande färgämnen i vaskulaturen eller använda musmodeller som exogent uttrycker fluorescerande proteiner för att avgränsa fysiska egenskaper. Injicerbara färgämnen och substrat som fluorescerande dextrans används i stor utsträckning för att framgångsrikt märka vaskulaturen i intravitala samlingar19, 23, 24. Detta tillvägagångssätt är dock inte utan begränsningar. För det första kräver det ytterligare musmanipuleringar och dess användbarhet är begränsad till kortsiktiga experiment. För longitudinella studier kan fluorescerande dextran vara problematiskt eftersom vi observerar ackumulering av dextran i fagocytiska celler eller diffusion i den omgivande vävnaden över tid25. Exogen fluorescerande proteininkorporering i musmodellen har presenterats som ett alternativ till fluorescerande dextrans men presenterar egna begränsningar. Tillgängligheten och mångfalden av exogena fluoroforer inom musmodeller är fortfarande begränsad och dyr att skapa. Dessutom, i specifika modeller, såsom PDX-modeller, är genetiska manipuleringar inte önskvärda eller möjliga. Det har också visats att närvaron av fluorescerande eller bioluminescerande proteiner i celler erkänns som främmande i musen, och inom immunkompetenta musmodeller minskar detta mängden metastasering på grund av svaret från värdimmunsystemet26,27. Slutligen upptar exogena fluorescerande proteiner eller fluorescerande färgämnen som används för rumslig kontext eller för att segmentera efterföljande data ofta primområden av ljusspektrumet som annars skulle kunna användas för att undersöka de fysiologiska interaktionerna av intresse.
Användningen av den inneboende signalen från ECM eller endogen fluorescens från celler i vävnaden representerar ett potentiellt universellt etikettfritt sätt att segmentera intravitala data för mer djupgående cellulär och rumslig analys. Andra harmoniska generationen (SHG) har länge använts för att visualisera ECM28. Med den efterföljande utvecklingen av viktiga verktyg för att hjälpa till vid karakteriseringen av fiberorganisationen 29,30,31 är det möjligt att karakterisera cellbeteende i förhållande till lokal ECM-struktur. Dessutom ger autofluorescens från den endogena metaboliten, NAD (P) H, ett annat etikettfritt verktyg för att dela upp tumörmikromiljön in vivo. NAD(P)H fluorescerar starkt i tumörceller och kan användas för att diskriminera gränserna för det växande tumörboet från dess omgivande stroma 21,32. Slutligen är vaskulaturen en viktig fysiologisk struktur i tumörmikromiljön och platsen för viktiga celltypsspecifika interaktioner 33,34,35. Excitationen av röda blodkroppar (RBC) eller blodplasma har använts för att visualisera tumörkärlen, och med hjälp av två- eller trefotonexcitation (2P; 3P) har mätningen av blodflödeshastigheter visat sig vara möjlig36. Men medan större blodkärl lätt kan identifieras med sina endogena fluorescenssignaturer, kräver identifieringen av subtila, variabla och mindre fluorescerande små blodkärl mer expertis. Dessa inneboende svårigheter hindrar optimal bildsegmentering. Lyckligtvis kan dessa källor till endogen fluorescens (dvs. röda blodkroppar och blodplasma) också mätas genom fluorescens livstidsavbildning37, som utnyttjar vaskulaturens unika fotofysiska egenskaper och representerar ett användbart tillskott till den växande intravitala verktygslådan.
I detta protokoll beskrivs ett arbetsflöde för segmentering av fyrdimensionell (4D) intravital avbildning som uttryckligen använder inneboende signaler som endogen fluorescens och SHG från förvärv till analys. Detta protokoll är särskilt relevant för longitudinella studier genom ett bröstavbildningsfönster där exogen fluorescens kanske inte är praktisk eller möjlig, vilket är fallet med PDX-modeller. Segmenteringsprinciperna som beskrivs här är dock i stort sett tillämpliga på intravitala användare som undersöker tumörbiologi, vävnadsutveckling eller till och med normal vävnadsfysiologi. Den rapporterade sviten av analysmetoder gör det möjligt för användarna att skilja cellulärt beteende mellan regioner med inriktade eller slumpmässiga kollagenfiberkonfigurationer, jämföra antal eller beteenden hos celler som bor i specifika regioner i tumörmikromiljön och kartlägga vaskulaturen till tumörmikromiljön med endast etikettfri eller inneboende signal. Tillsammans skapar dessa metoder en operativ ram för att maximera djupet av information som erhållits från 4D intravital avbildning av bröstkörteln samtidigt som behovet av ytterligare exogena etiketter minimeras.
4D intravital avbildning är ett kraftfullt verktyg för att undersöka dynamiska fysiologiska interaktioner inom det rumsliga och tidsmässiga sammanhanget för den ursprungliga tumörmikromiljön. Detta manuskript ger en mycket grundläggande och anpassningsbar operativ ram för att dela upp dynamiska cellinteraktioner inom tumörmassan, den intilliggande stroma eller i närheten av det vaskulära nätverket med endast endogena signaler från andra harmoniska generationen eller NAD (P) H autofluorescens. Detta protokol…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill erkänna NCI R01 CA216248, CA206458 och CA179556 bidrag för finansiering av detta arbete. Vi vill också tacka Dr. Kevin Eliceiri och hans bildgrupp för deras tekniska expertis i den tidiga utvecklingen av vårt intravitala program. Vi tackar också Dr. Ben Cox och andra medlemmar i Eliceiri Fabrication Group vid Morgridge Institute for Research för deras viktiga tekniska design under de tidiga faserna av MIW. Dr Ellen Dobson hjälpte till med användbara samtal om ImageJ-träningsbart WEKA-segmenteringsverktyg. Dessutom vill vi tacka Dr. Melissa Skala och Dr. Alexa Barres-Heaton för snabb användning av deras mikroskop. Slutligen vill vi tacka Dr. Brigitte Raabe, D.V.M, för alla tankeväckande diskussioner och råd om vår mushantering och vård.
#1.5 12mm round cover glass | Warner Instruments | # 64-0712 | MIW construction |
1.0 mL syringe for SQ injection | BD | 309659 | Syringe |
20x objective | Zeiss | 421452-988 | Water immersion |
27G needle for SQ injection | Covidien | 1188827012 | Needle |
40x objective | Nikon | MRD77410 | Water immersion |
5-0 silk braided suture | Ethicon | K870 | Suture for MIW implantation |
Artificial tears gel | Akorn | NDC 59399-162-35 | Eye gel |
Betadine solution, 5% | Fisher Scientific | NC1558063 | Surgery antiseptic |
cotton-tipped applicator | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 1365882 | MIW construction |
fluorescent dextran | Sigma | T1287-50mg | intravenous labelling of vasculature |
forceps | Mckesson.com | Miltex #18-782 | stainless, 4 inch, curved |
GaAsP photomultiplier tube | Hamamatsu | ||
heating blanket | CARA 72 heating pad | 038056000729 | Temperature selectable |
heating chamber | home built | ||
Fluorescent lifetime handbook | Becker and Hickl | https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks | |
inverted microscope base | Nikon | ||
Isoflurane | Akorn | NDC 59399-106-01 | Anesthesia |
Liqui-Nox | Fisher Scientific | 16-000-125 | MIW cleaning |
Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | Analgesic |
Micro Hose | Scientific Commodities INC. | BB31695-PE/1 | |
multiphoton scan head | Bruker Ultima II | Multiphoton scanhead and imaging platform | |
NADH FLIM filter | Chroma | 284994 | ET 440/80 m-2P |
Nair | CVS | 339826 | Depilatory cream |
objective heater | Tokai Hit | STRG-WELSX-SET | |
SHG/FAD filter | Chroma | 320740 | ET450/40m-2P |
Sparkle glass cleaner | Amazon.com | B00814ME24 | Glass Cleaner for implanted MIW |
SPC-150 photon counting board | Becker and Hickl | ||
surgical light | FAJ | B06XV1VQVZ | Magnetic LED gooseneck light |
surgical micro-scissors | Excelta | 366 | stainless, 3 inch |
Triple antibiotic ointment | Actavis Pharma | NDC 0472-0179-34 | Antibiotic |
TV catheter | Custom | BD 30G needle: 305106 | Catheter for TV injection |
Two photon filter | Chroma | 320282 | ET585/65m-2P |
two-photon laser | Coherent charmeleon | Tunable multiphoton laser | |
ultrasound gel | Parker | PKR-03-02 | Water immersion gel |
Urea crystals | Sigma | U5128-5G | Optional: FLIM IRF |