Summary
Burada, artık yumurta kalıntılarının sahada toplanmasına dayanan kelebek popülasyonlarının noninvaziv genetik örneklemesi için basit bir protokol sunuyoruz. Tür kimliğini doğrulamak ve genetik çeşitliliği ölçmek için kullanılabilir. Bu protokol, toplum bilimi katılımı için daha geniş gruplara kolayca uyarlanabilir.
Abstract
Küresel böcek düşüşleri hızlanmaya devam ediyor. Etkili genetik örnekleme, birçok taksonun anlaşılmasını ilerletmek ve mevcut bilgi boşluklarını gidermek için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, popülasyon genetik yapısı veya DNA barkodlama analizleri için nadir kelebekleri tahribatsız bir şekilde örneklemek için kanıtlanmış bir yöntemi temsil eder. Tür kimliğini doğrulamak ve genetik çeşitliliği ölçmek için başarılı gen dizilimi için yeterince yüksek miktarda ve kaliteli DNA elde etmek için yumurtadan çıkmış kelebek ovalarının koryonunu kullanır. Diğer doku örnekleme teknikleri pratik olmadığında veya kullanılamadığında özellikle yararlı olabilir. Bir lepidopteran için geliştirilmiş olsa da, yine de diğer böcek türleriyle kullanım için kolayca uyarlanabilir. Topluluk bilimcileri, koruma uygulayıcıları ve öğrenciler gibi farklı deneyim ve beceri seviyelerine sahip bireyler tarafından geniş uygulamayı en üst düzeye çıkarmaya yardımcı olmak ve geniş nüfus örneklemesini kolaylaştırmak için geniş coğrafi alanlarda kullanılmak üzere kullanım kolaylığı ile özel olarak tasarlanmıştır. Üretilen veriler, taksonomik ve listeleme kararlarını, koruma ve yönetim eylemlerini bilgilendirmeye ve temel ekolojik araştırmaları geliştirmeye yardımcı olabilir.
Introduction
Nadir, azalan ve / veya listelenen böcek taksonlarının etkili popülasyon genetik örneklemi, koruma ve yönetim eylemlerini bilgilendirmeye yardımcı olmak için genellikle kritik öneme sahiptir. Ölümcül veya zararlı doku örnekleme yöntemleri birçok genetik analiz için rutin olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, bu yöntemler istenmeyen veya izin verilmemektedir, çünkü savunmasız mevcut popülasyonlara zarar verebilir veya davranış ve zindeliği olumsuz yönde etkileyebilir. Tüm bacaklar, anten veya kanat kırpıntıları, larva eksüviya veya savunma sekresyonlarından ve frass gibi diğer ürünlerden hemolenf gibi dokuları içeren çeşitli ölümcül olmayan veya invaziv olmayan örnekleme teknikleri, böcek genetik araştırmaları için uygundur 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Bu çeşitli doku örnekleme tekniklerinin genel fizibilitesi ve uygulanabilirliği, odak organizmanın, durumun ve materyali toplayan bireylerin biyolojisine, ekolojisine, davranışına, boyutuna ve nadirliğine bağlı olarak önemli ölçüde değişir. Örneğin, tüm bacaklar veya ek kırpıntılar, tipik olarak deneyimli personel tarafından, uygun bir yaşam evresindeki birkaç kişinin geçici olarak yakalanmasını ve dikkatli bir şekilde kullanılmasını gerektirir. Benzer şekilde, larva eksüviae veya frass gibi doku kaynaklarının, organizmalar esaret altında veya yeterli bir süre geçici olarak tutulduklarında pratik olmaları muhtemeldir.
Potansiyel taksonomik farklılaşma veya genetik yapı ile ilgili olanlar gibi popülasyon düzeyinde sorulan araştırma soruları için, daha geniş bir zamansal veya coğrafi ölçekte (yani, bölgesel veya kıtasal) örnekleme genellikle gereklidir. Sonuç olarak, bazı invaziv olmayan doku kaynakları tamamen pratik olmayabilir veya en azından miktar olarak toplanması verimsiz olabilir. Bu ölçeklerde numune toplama, bireysel araştırmacılar veya hatta daha küçük saha ekipleri için lojistik veya finansal olarak pratik olmayabilir veya engelleyici olabilir. Topluluk bilim adamlarının doğrudan katılımı, bu zorlukların çoğunun ele alınmasına ve büyük veri odaklı toplamanın hızlandırılmasına yardımcı olmak için araştırma topluluğu tarafından giderek daha fazla benimsenmiş olsa da, tahribatsız, invaziv olmayan veya eDNA örneklemesi 10,11,12'yi içeren çalışmalar için benimseme sınırlandırılmıştır.
Bu potansiyel sınırlamaların bazılarının üstesinden gelmeye yardımcı olmak için, yumurtadan çıkmış kelebek ovasından elde edilen koryonun, tür kimliğini doğrulamak ve genetik çeşitliliği ölçmek için başarılı gen dizilimi için yeterince yüksek miktarda ve kalitede DNA üretebileceğini gösterdik. Daha sonra bu tekniği kullanarak çeşitli toplama protokollerini test ettik13. Bu pilot çalışma, daha fazla metodolojik iyileştirme için temel oluşturdu. Bu makale, topluluk bilimcileri ve diğer uzman olmayan personel için ortaya çıkan basit ama kapsamlı revize edilmiş saha toplama protokolünü ayrıntılı olarak açıklamaktadır. Bu protokol, gelecekteki koruma eylemlerini bilgilendirmeye yardımcı olmak için buzlu elfin kelebeğinin (Callophrys irus) geniş bir popülasyon yapısı analizinin ve ABD Nesli Tükenmekte Olan Türler Yasası kapsamında muhtemelen listelenmenin federal bir kararının bir parçasıdır. Bazı invaziv olmayan yöntemlerden potansiyel olarak daha fazla emek yoğun olmasına rağmen, gerekli organizma temasının olmaması ve kullanım kolaylığı, onu hem yaygın böceklerin hem de koruma kaygısı olanların bir seçimini hedefleyen diğer popülasyon genetik araştırma programlarına uygulanabilecek potansiyel olarak uygulanabilir bir model haline getirmektedir. Burada sunulan protokol dili, özellikle Lycaenidae familyasındaki kelebekler için ve burada topluluk bilimcileri veya sınırlı entomolojik deneyime sahip diğer bireyler (örneğin, ajans biyologları, stajyerler) olarak tanımlanan uzman olmayanlar tarafından kullanılmak üzere geliştirilmiştir.
Protocol
1. Malzemelerin toplum bilimcilerine yayılması
- Malzeme Tablosunun tamamına danışarak koleksiyonla ilgili malzemelerin tam listesini dikkatlice inceleyin ve toplayın.
- Numune toplama birden fazla yerde ve/veya birden fazla kişi/ekip tarafından gerçekleştirilecekse, ihtiyaç duyulan tüm malzemeleri ayrı konuşlandırılabilir birimlerde toplayın ve düzenleyin (Şekil 1 ve Şekil 2).
- Malzemeleri (konuşlandırılabilir birimler) topluluk bilim insanlarına veya saha toplamadan sorumlu diğer personele taşımak.
- Personel yerel değilse, malzemeleri (her konuşlandırılabilir ünite) eksiksiz bir nakliye etiketi ve gemi ile ayrı bir karton nakliye kutusuna dikkatlice paketleyin.
NOT: Bu aşamada hızlandırılmış gönderi gerekli değildir.
2. Toplum bilimci koleksiyonu hazırlığı
- Toplama işlem kutusu da dahil olmak üzere toplama malzemeleri alındıktan sonra, lamine tedarik listesini dikkatlice gözden geçirin ve tam bir envanter yapın. Herhangi bir malzeme eksikse proje liderini bilgilendirin.
- 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerini 180 μL lizis tamponu ile önceden doldurun, her bir mikrosantrifüj tüpüne önceden basılmış benzersiz bir kimlik etiketine sahip etiketler uygulayın ve tüm tüpleri 64 delikli mikrosantrifüj tüpleri saklama kutusuna yerleştirin. Yükledikten sonra kapağı sıkıca sabitleyin.
NOT: Etiket yazıcıları mevcut değilse, etanol geçirmez bir işaretleyici kullanarak her şişenin yan ve kapağına benzersiz kimlik numaraları uygulayın. - Tüm dijital ekipmanların (ör. akıllı telefon veya kamera) tamamen şarj olduğundan ve yedek pillerin dolu olduğundan emin olun.
- Sahada depolama ve toplanan örneklerin yerel olarak taşınması için küçük bir soğutucuyu kısmen buzla doldurun.
- Güvenli taşıma ve konsolide depolama için tüm toplama malzemelerini toplama çantasına veya benzeri sağlam, hava koşullarına dayanıklı bir kaba koyun.
- Sahaya girmeden önce tahribatsız genetik örnek toplama protokolünü ayrıntılı olarak gözden geçirin.
NOT: Alanda ek rehberlik için lamine ve yoğunlaştırılmış, resimli protokolü kullanın (Ek Şekil S1 ve Ek Şekil S2).
3. Sahada örnek toplama
- Saha sahasına vardıktan sonra, hava koşullarına dayanıklı alan defterine günün saatini, tarihini, genel mülk adını (örneğin, Apalachicola Ulusal Ormanı), belirli saha yeri konumu adını veya açıklamasını ve varsa GPS okumasını ve mevcut tüm kişilerin tam adını ve rollerini kaydetmek için bir kalem veya her türlü hava koşulunda kalem kullanın.
- Hedef kelebeğe özgü larva konakçı bitki türlerinin varlığı ile uygun bir habitat bulun.
NOT: Hassas habitatlara, bitki popülasyonlarına ve vahşi yaşama olan etkiyi önlemek veya en aza indirmek için dikkatli olun. Ayrıca, bir siteye ve örnek toplama olaylarına erişmeden önce tüm uygun arazi sahibi izinlerini ve / veya izinlerini güvence altına aldığınızdan emin olun. - Bir akıllı telefon veya kamera kullanarak, tüm saha sahalarının, numune toplama yerlerinin, ev sahibi tesislerin ve projeyle ilgili olabilecek diğer bilgilerin ayrıntılı fotoğraflarını çekin. GPS koordinatlarını kaydeden akıllı telefonlar veya diğer kameralar kullanın.
NOT: Fotoğraf Coğrafi Etiketlemenin tüm akıllı telefonlarda etkinleştirilmesi gerekir. - Yumurtadan çıkmış yumurtalar için yetişkin dişi kelebeklerin yumurtlamasıyla (yumurtlayan) seçildiği bilinen yapraklar, çiçek tomurcukları, çiçekler veya gelişmekte olan meyveler gibi tüm larva konakçı bitki kısımlarını kapsamlı bir şekilde araştırın. Çoğu Lycaenidae için, merkezinde yenidoğan larvaların ortaya çıktığı bir çöreğe benzeyen belirgin bir deliğe sahip beyaz, yumurtadan çıkmış yumurtaları arayın (Şekil 3). Biraz daha koyu renkli, genellikle yeşil veya mavimsi olan ve ortada bir delik olmadan tamamen bozulmamış olacak yumurtaları arayın (Şekil 4). Her yumurtayı yakından incelemek için bir el lensi veya başka bir büyüteç cihazı kullanın.
- Yumurtadan çıkmış bir yumurta bulunduktan sonra, her iki elinize de nitril eldiven koyun.
- Temiz, steril, sivri uçlu forseps kullanarak, yumurtadan çıkmış yumurtayı konakçı bitkiden alın ve yavaşça çekin ve doğrudan 64 delikli saklama kutusundan alınan lizis tamponu ile önceden doldurulmuş etiketli bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
NOT: Bazı konakçı bitki taşıma malzemeleri (çapı 15 mm'den küçük) toplama sırasında kabul edilebilir ve normaldir. - Konakçı bitki yaması/sahası başına (her biri 1-20 yumurtadan çıkmış yumurta içeren) en az 5 örnek toplayın ve varsa bir yerde toplam >50 yumurta elde edin.
NOT: Bu, her örnek bitkide / yamada en azından bir miktar dokunun toplanmasını sağlamaya yardımcı olacak ve DNA'yı tespit etme şansını artıracaktır (kişisel gözlem). - Her yumurta toplamadan sonra, forseps uçlarını% 95 etanol şişesine batırarak veya sıkma şişesinden% 95 etanol ile doldurarak veya alkollü mendiller kullanarak dikkatlice temizleyin.
NOT: Bu, örnekleme olayları arasında doku taşınmasını en aza indirmeye yardımcı olacaktır. - Varsa, aynı konakçı yamadaki birden fazla bitkiden birkaç yumurtadan çıkmış yumurtayı (1-20 yumurta) tek bir mikrosantrifüj tüpüne toplayın ve kapağı sıkıca kapatın. Daha büyük otsu veya odunsu konakçı türleri kullanan kelebek türleri için, konakçı yamaları sınırlıysa, aynı bitkinin farklı yerlerinden birden fazla yumurta toplayın.
NOT: Bitkiler, yaprakları birbirine temas ederse aynı konakçı yamasında bulunurlar. Bitkiler veya yamalar arasında gözle görülür bir fiziksel ayrım varsa, bu farklı bir örnek olarak düşünülmelidir. Larva eksüviae veya tek bir bacak gibi başka bir doku tipi topluyorsanız, bir mikrosantrifüj tüpüne (birey başına bir örnek) yalnızca tek bir bacak, bacak parçası veya larva eksüvia yerleştirin. - Toplanan tüm malzemelerin, her 1,5 mL mikrosantrifüj tüpü içindeki lizis tamponuna tamamen batırıldığından emin olun. Gerekirse herhangi bir numuneyi yeniden batırmak için söz konusu tüpün tabanına sert bir yüzeye dokunun.
- Forsepsleri temiz bir tek kullanımlık laboratuvar mendili ile kuruması için silin.
NOT: Numuneler arasında çapraz kontaminasyonu önlemek için dikkatli forseps temizliği şarttır. - Yeni bir numune toplarken, kullanılmış nitril eldivenleri atın ve temiz bir çiftle değiştirin.
- Hava koşullarına dayanıklı bir alan defterinde, mikrosantrifüj tüpünden atanan benzersiz kimlik etiketini, numune türü (örneğin, yumurtalar, larva eksüviaları veya bacak), taranan yumurtaların yaklaşık sayısı ve toplayıcı ad(lar)ı, tarih, konum, konakçı bitki türleri ve ek notlar gibi koleksiyon bilgileriyle birlikte kaydetmek için bir kalem veya her türlü hava koşulunda kalem kullanın (Şekil 2).
- Kapalı mikrosantrifüj tüpünü yumurta artıkları örneği ile birlikte 64 delikli mikrosantrifüj saklama kutusuna geri yerleştirin.
- 64 delikli mikrosantrifüj saklama kutusunu sahadayken buzlu bir soğutucuda saklayın.
- Güvenli ve konsolide depolama ve sahalar arasında nakliye için sahadayken diğer tüm toplama malzemelerini toplama işlem kutusunda tutun.
4. Alan koleksiyonu tamamlandığında
- Numune içeren tüm mikrosantrifüj tüplerinin, taşıma için buzlu bir soğutucuda 64 delikli mikrosantrifüj saklama kutusunda bulunduğundan emin olun.
- Tüm saha koleksiyonu malzemelerini koleksiyon mücadele kutusuna geri yerleştirin.
- Tüm numuneleri ofise veya laboratuvara geri taşıyın ve tüm numune malzemesinin lizis tamponuna tamamen batırıldığından emin olmak için her bir mikrosantrifüj tüpünü dikkatlice iki kez kontrol edin.
- 64 delikli mikrosantrifüj saklama kutusunu, numunelerle birlikte sevkiyat veya işleme kadar dondurucuya koyun.
NOT: Kısa süreli depolama için ortalama 18 °C'lik bir ticari dondurucu kabul edilebilir. - Toplama araç kutusundaki tüm malzemeleri dikkatlice değerlendirin ve gerektiğinde değiştirin.
NOT: Bu, özellikle birden çok alan toplama olayı zamanlanmışsa önemlidir. - Koleksiyon mücadele kutusunu bir sonraki saha koleksiyonu etkinliğine kadar güvenli bir yerde saklayın.
- Tüm dijital görüntüleri indirin ve hepsinin bir sunucuda veya bulut tabanlı depolama sisteminde güvenli bir şekilde yedeklendiğinden emin olun.
- Tüm bilgiler bir proje elektronik tablosuna veya veritabanına girilene kadar orijinal hava koşullarına dayanıklı, saha not defteri sayfalarını veya koleksiyon verilerini içeren saha veri sayfalarını tarayın veya fotoğraflayın.
5. Örneklerin ve verilerin gönderilmesi
- 64 delikli mikrosantrifüj saklama kutularının tümünü dondurucudan numunelerle çıkarın.
- 64 delikli mikrosantrifüj saklama kutularını numuneler ve saha defteri veya saha veri sayfaları ile standart bir nakliye kutusunda dikkatlice paketleyin, sağlanan nakliye etiketini orijinal gönderenin hesap numarasıyla yapıştırın ve ekspres taşıyıcı garantili, gecelik, ertesi gün teslimat yoluyla proje direktörüne gönderin.
- Paket takip numarasını ve taranan not defteri sayfalarının veya saha veri sayfalarının bir kopyasını proje yöneticisine e-postayla gönderin.
6. DNA ekstraksiyonu
- 64 delikli mikrosantrifüj saklama kutuları alındıktan sonra, DNA ekstraksiyonuna hazır olana kadar DNA'nın numunelerde korunması için -20 ° C'de saklayın.
- Laboratuvarda, -20 ° C'den çözüldükten sonra lizis tamponunda depolanan böcek dokusunu öğüterek DNA'yı çıkarın. 20 μL Proteinaz K ekleyin ve numunenin 56 ° C'de gece boyunca ısıtılmış bir inkübatörde 24 saatten fazla olmamak üzere ıslanmasına izin verin.
- Belirli üreticinin tavsiyesine göre uygun temizleme ve yıkama tamponlarını ekleyin13.
- Tamponda asılı duran numuneyi, 2 mL'lik bir toplama şişesine bağlı bir spin kolonuna aktarın.
- Bir santrifüj kullanarak 60 s için 6.021 × g'da döndürün. Uygun yıkama tamponlarını ekleyin ve uygun şekilde aşağı doğru döndürün.
- Elüzyon tamponu (30 μL) kullanarak bağlı DNA'yı serbest bırakın ve numuneyi taze bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne dönüştürün. -20 °C'de saklayın.
NOT: DNA konsantrasyonu 0.010 ng / mL'yi aşarsa dizilemeye devam edin. Doku tipine göre DNA konsantrasyonu için Şekil 5'e bakınız.
7. DNA dizilerinin veri analizi
- Düşük kaliteli temel çağrıları sonuçta ortaya çıkan dizilerde kırpın veya düzenleyin.
- Tür tanımlamasının doğrulanması için genel veritabanlarına karşı sorgu dizileri.
- Bireyler arasındaki farkların karşılaştırılması için dizileri birbiriyle hizalayın.
Representative Results
563'e kadar örnek toplamak için materyaller, doğu Kuzey Amerika'daki türler arasındaki dokuz eyaletten sekiz koruma ve topluluk bilim adamına gönderildi. Malzemeler, yerel yoğun uçuş saatlerinden önce 2021 boyunca üç ay boyunca gönderildi. Bugüne kadar toplanan toplam 160 adet C. irus doku örneği alınmıştır (Tablo 1). Genomik DNA, Storer ve ark.14 tarafından detaylandırılan bu örnek tipi için bir protokol izlenerek çıkarıldı. Bu 160 örnekten DNA, ortalama 1.67 ng / μL konsantrasyonu (SE ± 2.98) ile 88'den başarıyla çıkarıldı ve en yüksek DNA verimi 26.8 ng / μL idi. Konsantrasyonlar, üreticinin talimatlarına göre 2 μL ekstrakt içeren yüksek hassasiyetli bir tahlil kiti kullanılarak ölçüldü.
Alınan toplam numune sayısı, toplama için konuşlandırılan toplam materyal sayısından önemli ölçüde daha düşük olsa da, bu ağırlıklı olarak, birincil koleksiyoncuya veya ekip liderine, istenirse birden fazla toplama alanı ve / veya topluluk bilim insanını dahil etmek için maksimum esnekliğe sahip olmalarını sağlamak için aşırı miktarda toplama materyali sağlama eseridir. Dahası, C. iris, mevcut aralığı boyunca sınırlı ve genellikle nispeten küçük popülasyonlar tarafından temsil edilen nadir ve azalan bir taksondur. Bu kısıtlamaya rağmen, alınan toplam doku örneği sayısı, özellikle bireysel yetişkin kelebeklerin daha geleneksel bir örneklemesiyle beklenenlerle karşılaştırıldığında önemlidir.
Şekil 1: Topluluk bilim insanlarına veya saha koleksiyonundan sorumlu diğer personele gönderilmeyi bekleyen gerekli tüm malzemelerin bireysel konuşlandırılabilir birimleri. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Tüm sarf malzemeleri, şeffaf plastik toplama mücadele kutusu ve topluluk bilimcilerine veya saha koleksiyonundan sorumlu diğer personele gönderilmeyi bekleyen tamamlanmış ekspres taşıyıcı etiketi dahil olmak üzere bireysel konuşlandırılabilir ünite. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 3: Yabani lupin (Lupinus perennis) üzerindeki yumurtadan çıkmış buzlu elfin kelebeği (Callophrys irus) yumurtasının fotoğrafı, yenidoğan larvaların ortaya çıktığı merkezde belirgin bir delik göstermektedir. Yumurtadan çıkan yumurtanın genel renginin beyaz olduğunu unutmayın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 4: Yabani lupin (Lupinus perennis) üzerinde yumurtadan çıkmamış yumurtadan çıkmış buzlu elfin kelebeği (Callophrys irus) yumurtalarının fotoğrafı. Yumurtadan çıkmamış yumurtaların gözle görülür bir merkezi delikten yoksun olduğunu ve genel renklerinin mavimsi yeşil olduğunu unutmayın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Doku tipine göre DNA konsantrasyonu. Kutu orta çizgileri medyanı temsil eder, her kutu IQR'yi uzatır ve kutu bıyıkları IQR'× 1,5'tir ve dışarıdaki noktalar aykırı değerlerdir. Tek bir yumurta kutusu içeren örneklerde sadece bir yumurta kutusu vardı ve birden fazla yumurta kutusu içeren örneklerde en az iki vaka vardı ve vaka sayısı numune başına 2 ila 20 (ortalama = 5.3) arasında değişiyordu. Kısaltma: IQR = çeyrekler arası aralık. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Devlet | Yumurta kılıfı | Yumurta kasaları | Fransa | Bacak | Arjantin | Genel Toplam |
| Arkansas | 2 | 2 | ||||
| Florida | 3 | 10 | 7 | 22 | 42 | |
| Michigan | ||||||
| New Hampshire | 24 | 6 | 15 | 45 | ||
| New York | 30 | 30 | ||||
| Ohio | ||||||
| Wisconsin | 9 | 5 | 5 | 19 | ||
| Oklahoma | 16 | 6 | 22 | |||
| Genel Toplam | 36 | 21 | 16 | 65 | 22 | 160 |
Tablo 1: Devlet tarafından toplanan doku materyalinin sayısı ve türü.
Ek Şekil S1: Sahada kullanılmak üzere iki taraflı, lamine edilmiş, yoğunlaştırılmış ve resimli protokolün ön sayfası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil S2. Sahada kullanılmak üzere iki taraflı, lamine edilmiş, yoğunlaştırılmış, resimli protokolün arka sayfası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Discussion
Bu protokol, popülasyon genetik yapısı veya DNA barkodlama analizleri için nadir kelebekleri tahribatsız bir şekilde örneklemek için bir alan yöntemini açıklamaktadır. Bu protokolün genel faydaları, topluluk bilimcileri, koruma uygulayıcıları ve öğrenciler gibi farklı deneyim ve beceri seviyelerine sahip bireyler tarafından geniş uygulamayı en üst düzeye çıkarmaya yardımcı olmak için özel olarak tasarlanmıştır. Bunlar arasında nispeten düşük genel maliyet, edinilmesi kolay sarf malzemeleri ve ekipman, çok sayıda aşırı karmaşık adım olmadan basit ve ulaşılabilir bir yöntem ve geniş bir coğrafi alanda kolay dağıtım yer almaktadır. Ek olarak, geçici olarak yakalama veya manipüle etme ihtiyacını ortadan kaldıran ve bu süreçte genetik örnekler elde etmek için canlı organizmalara potansiyel olarak zarar veren artık organik materyali hedefler. Ayrıca, numune toplama için mevcut potansiyel süreyi geleneksel fenolojinin veya belirli bir yaşam aşamasının ömrünün ötesine uzatarak, numune sayılarını en üst düzeye çıkarmaya yardımcı olmak için esnekliği ve genel toplama fırsatını arttırır.
Bu çabanın odak taksonu, yaygın fakat azalan bir habitat uzmanı olan buzlu elfin kelebeği iken, bu protokol, koruma kaygısı da dahil olmak üzere diğer birçok böceğe daha geniş bir şekilde uygulanabilir. Benzer şekilde, protokol genetik materyalin kaynağı olarak yumurtadan çıkmış yumurtaların toplanmasını hedeflerken, potansiyel olarak daha geleneksel olan diğer örneklere (örneğin, bacaklar, kanat parçaları, anten klipsleri) ve hatta tüm organizmalara kolayca uyarlanabilir. Bununla birlikte, bu yön aynı zamanda protokolün potansiyel bir sınırlamasıdır. Adımların büyük çoğunluğu nispeten basit ve hızlı bir şekilde gerçekleştirilecek şekilde tasarlanmış olsa da, larva konakçı bitkilerin yamalarını, bireysel olarak tipik olarak <1.0 mm çapında olan kuluçkalık yumurtalar için kapsamlı bir şekilde araştırmak zaman ve emek yoğundur. Bununla birlikte, bu tür kapsamlı örnekleme aktivitesi, toplum bilimcileri gibi daha geniş bir katılımcı ağı için özellikle idealdir.
Diğer saha bazlı projelerde olduğu gibi, dikkatli bir hazırlık şarttır. Bu, hiçbir öğenin eksik olmamasını, gerekli hazırlık çalışmalarının tamamlanmasını ve iyi organize edilmiş, güvenli bir şekilde paketlenmiş ve saha dağıtımına hazır olmalarını sağlamak için gereken malzemelerin tam bir envanterinin yapılmasını içerir. Buna ek olarak, tüm saha personeli, özellikle doku toplamayı yürütenler, herhangi bir toplama etkinliğinden önce toplama protokolünü ayrıntılı olarak gözden geçirmeli ve projeyi denetleyen kişilere herhangi bir soruyu yöneltmelidir. Sahaya girdikten sonra, protokolün numune toplama kısmı detaylara titizlikle dikkat edilmesini gerektirir. Bu, yumurtadan çıktıklarından ve dolayısıyla toplanmaya uygun olduklarından emin olmak için herhangi bir ovanın yerini belirlemeyi ve dikkatlice incelemeyi, forsepsleri iyice temizlemeyi, örnekleme olayları arasında doku taşınmasını azaltmaya yardımcı olmak için eldivenlerin değiştirilmesini ve doku örneklerinin her 1,5 mL mikrosantrifüj tüpü içindeki lizis tamponuna tamamen batırılmasını sağlamayı içerir. Son olarak, mikrosantrifüj tüpünden atanan benzersiz kimlik etiketini, alınan spesifik numune ve diğer tüm ilgili toplama bilgileriyle ilişkilendirmeyi içeren doğru ve ayrıntılı verilerin kaydedilmesi esastır. Bu adım bilimsel araştırmalarda rutin olsa da, genellikle bir topluluk bilimi izleyicisi için iyice açıklığa kavuşturulması ve güçlendirilmesi gerekir.
Burada, topluluk bilim adamlarının küçük, nadir ve tehdit altındaki türlerden ölümcül olmayan numune toplama potansiyelinden yararlanma potansiyelini gösteriyoruz. Bununla birlikte, ortaya çıkan genetik verileri analiz ederken akılda tutulması gereken bazı potansiyel sınırlamalar vardır. Örneğin, tek bir yamadan örneklerin bir araya getirilmesi, tespit için yeterli DNA'nın geri kazanılma şansını arttırırken, potansiyel olarak heterozigotluğu da beraberinde getirir. Ek olarak, protokol koryonun taranmış ovadan toplanmasını içerdiğinden, sadece ebeveyn DNA'sını temsil eden dişi kelebekler bir popülasyon içinde örneklenebilir. Bununla birlikte, C. irus için daha önce popülasyon düzeyinde genetik veri bulunmadığından, elde edilen bilgiler yalnızca türlerin korunmasına ve yönetimine fayda sağlayabilir. Örneğin, popülasyon yapısını yeterince değerlendirmek için kapsamlı, ayrıntılı bir çalışma tasarımı ve dikkatli bir belirteç seçimi gerekli olsa da, burada özetlenen örnekleme protokolü ve sitokrom c oksidaz alt birimi 1 (CO1) DNA barkodlamasının kullanılması, nadir veya tehlikede olan taksonların oluşumunu tespit etmek için kullanılabilir. Burada açıklanan ölümcül olmayan örneklemeden DNA diziliminin yararı ve uygulaması hakkında ek tartışmalar Storer et tarafından detaylandırılmıştır. al.14.
Genetik analiz için örnekler toplamanın birincil amacının ötesinde, protokol ayrıca katılımcıların tüm saha alanlarının, toplama yerlerinin, larva konakçı bitkilerin ve çevredeki habitatın ilgili olabilecek diğer unsurlarının ayrıntılı dijital fotoğraflarını çektiğini vurgulamaktadır. Bu tür belgeler, bitki fenolojisi, konakçı kaynak yoğunluğu ve yönetim geçmişi (örneğin, yakın zamanda öngörülen yangın) gibi mevcut saha koşullarını göstermek için yararlı olan genel bir habitat değerlendirmesi sağlamaya yardımcı olur. Bu tür bilgiler, daha ayrıntılı çevresel karşılaştırmalar sağlamak için saha örneklerinin daha geniş bir zamansal süre boyunca alındığı projeler için özellikle yararlıdır.
Son olarak, küresel böcek düşüşleri hızlanmaya devam ettikçe, genişletilmiş türlerin değerlendirilmesi ve izlenmesi çabalarına kritik olarak ihtiyaç duyulmaktadır15,16. Topluluk bilim adamlarından, öğrencilerden (örneğin, ABD Balık ve Yaban Hayatı Hizmeti stajyerleri ve arkadaşları) ve koruma uygulayıcılarından daha yaygın katılımcı katılımın kullanılması, DNA örnekleri de dahil olmak üzere birçok türde kapsamlı veri toplama için giderek daha uygun seçenekler sunmaktadır. Buna göre, bu protokolden üretilen verilerin birçok olası kullanımı vardır. Bunlar, koruma eylemlerini (örneğin, planlama, kurtarma ve yönetim) bilgilendirmeye yardımcı olmayı, kararları veya tür durumu değerlendirmelerini listelemeyi ve ekolojik, popülasyon ve taksonomik araştırmaları içerir.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, David Cuthrell, Amanda Dillon, Steve Fuller, Neil Gifford, Heidi Holman, Dean Jue, Sally Jue, Daniel Kennedy, Genevieve Kozak, Rebecca Longenecker, Maureen McClung, Matt Moran, Robin Niver, Brenda Smith, Hunter Trowbridge ve Jessup Weichelt'e lojistik, koordinasyon, izin ve / veya örnek toplama dahil olmak üzere projenin çeşitli yönleriyle ilgili yardımları için teşekkür etmek istiyor. Bu araştırma, Yaban Hayatı Yönetim Enstitüsü (hibe SA 2021-01) tarafından yönetilen ABD Balık ve Yaban Hayatı Servisi'nden (Federal Ödül Kimlik Numarası F20AC00356) bir hibe ile finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 quart Igloo Playmate Cooler | Amazon | NA | portable cooler Amount per deployable unit: 1 cooler |
| 250 DNeasy Mini Spin Columns, Proteinase K, Buffers, Collection Tubes (2 mL) | Qiagen | 69506 | Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit Amount per deployable unit: NA |
| Andwin Scientific Supplier Diversity Partner LAB MARKERS BLACK | FisherSci | NC9280166 | ethanol proof lab marker Amount per deployable unit: 2 markers |
| Cardboard shipping box | shipping box Amount per deployable unit: as needed |
||
| Eisco Polyethylene Wash Bottles, LDPE | FisherSci | S14091 | lab grade spray or squirt bottle (for ethanol or alcohol) Amount per deployable unit: 1 bottle |
| FedEx U.S. express airbill | FedEx | NA | shipping return label Amount per deployable unit: 2 labels |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | FisherSci | NC9386261 | sterile 1.5 mL microcentrifuge tubes Amount per deployable unit: 128 tubes |
| Forceps, #4a, very fine yet extra strong tips (33 mm), 4-3/8" (111 mm) long | Bioquip | 4523 | straight tip forceps Amount per deployable unit: 2 straight forceps |
| Forceps, #7, curved tips (13 mm), very fine points, 4-1/2" (114 mm) long | Bioquip | 4527 | curved tip forceps Amount per deployable unit: 2 curved forceps |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | FisherSci | 06-666A | kimwipes (or other sterile wipe) Amount per deployable unit: 1 box |
| Laminated Illustrated field collection protocol | NA | NA | abbreviated protocol Amount per deployable unit: 1 protocol |
| Laminated list of materials | NA | NA | supply list Amount per deployable unit: 1 list |
| Lily Sugar 'N Cream The Original Solid Yarn, 2.5 oz, Medium 4 Gauge, 100% Cotton - Hot Pink - Machine Wash & Dry | Amazon | NA | pink yarn (to secure to forceps for visibility) Amount per deployable unit: 2 yards |
| Loupe by Bausch & Lomb, 10x Coddington Magnifier | Amazon | NA | hand lens Amount per deployable unit: 2 hand lenses |
| MyGift Clear Plastic 2-Tier Trays Craft Supply Storage Box/First Aid Carrying Case w/Top Handle & Latch Lock | Amazon | NA | supply storage box Amount per deployable unit: 1 box |
| Nitrile, Disposable Gloves, L, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU14 | nitrile lab gloves (large) Amount per deployable unit: 1 box |
| Nitrile, Disposable Gloves, M, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU13 | nitrile lab gloves (medium) Amount per deployable unit: 1 box |
| Qiagen, Inc. BUFFER ATL (200 ML) | Qiagen | 19076 | Qiagen ATL lysis buffer Amount per deployable unit: 180 µl/tube; 128 tubes |
| Rite In The Rain Weatherproof Side Spiral Notebook, Yellow Cover, Universal Page Pattern (No. 373-MX), 11 x 8.75 x 0.5 | Amazon | NA | weatherproof field notebook Amount per deployable unit: 1 notebook |
| Showgard Professional Stamp Tongs 6" 904 Round Tip Tweezers | Amazon | NA | 6" spade tip forceps Amount per deployable unit: 2 long spade forceps |
| Texwipe PolySat Pre-Wetted Wipers | FisherSci | 18-366-231 | alcohol wipes Amount per deployable unit: 100 wipes |
| Thermo Scientific CryoBoxes | FisherSci | 12-565-227 | 64 well microcentrifuge tubes collection/storage boxes Amount per deployable unit: 2 boxes |
| packing material Amount per deployable unit: as needed |
References
- Donald, H. M., Wood, C. W., Benowitz, K. M., Johnson, R. A., Drodie, E. D. Nondestructive sampling of insect DNA from defensive secretion. Molecular Ecology Resources. 12 (5), 856-860 (2012).
- Feinstein, J. DNA sequence from butterfly frass and exuviae. Conservation Genetics. 5 (1), 103-104 (2004).
- Hamm, C. A., Aggarwal, D., Landis, D. A. Evaluating the impact of non-lethal DNA sampling on two butterflies, Vanessa cardui and Satyrodes Eurydice. Journal of Insect Conservation. 14, 11-18 (2010).
- Holehouse, K. A., Hammond, R. L., Bourke, A. F. G. Non-lethal sampling of DNA from bumblebees for conservation genetics. Insectes Sociaux. 50 (3), 277-285 (2003).
- Lushai, G., et al. Application of molecular techniques to non-lethal tissue samples of endangered butterfly population (Parnassius apollo L.) in Norway for conservation management. Biological Conservation. 94 (1), 43-50 (2000).
- Monroe, E. M., Lynch, C., Soluk, D. A., Britten, H. B. Nonlethal tissue sampling techniques and microsatellite markers used for first report of genetic diversity in two populations of the endangered Somatochlora hineana (Odonata: Corduliidae). Annals of the Entomological Society of America. 103 (6), 1012-1017 (2010).
- Oi, C. A., López-Uribe, M. M., Cervini, M., Del Lama, M. A. Non-lethal method of DNA sampling in euglossine bees supported by mark-recapture experiments and microsatellite genotyping. Journal of Insect Conservation. 17 (5), 1071-1079 (2013).
- Scriven, J. J., Woodall, L. C., Goulson, D. Nondestructive DNA sampling from bumblebee feces. Molecular Ecology Resources. 13 (2), 225-229 (2013).
- Watts, P. C., Thompson, D. J., Daguet, C., Kemp, S. J. Exuviae as a reliable source of DNA for population-genetic analysis of odonates. Odonatologica. 34 (2), 183-187 (2005).
- Andrews, K., et al. All hands on deck: local ecological knowledge and expert volunteers contribute to the first delisting of a marine fish species under the Endangered Species Act. Citizen Science: Theory and Practice. 4 (1), 37 (2019).
- Buxton, A., Groombridge, J., Griffiths, G. Comparison of two citizen scientist methods for collecting pond water samples for environmental DNA studies. Citizen Science: Theory and Practice. 3 (2), 2 (2018).
- Granroth-Wilding, H., et al. Non-invasive genetic monitoring involving citizen science enables reconstruction of current pack dynamics in a re-establishing wolf population. BMC Ecology. 17 (1), 44 (2017).
- Qiagen, DNeasy Blood & Tissue Kit Quick Start Protocol. , Available from: https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=63e22fd7-6eed-4bcb-8097-7ec77bcd4de6&lang=en (2016).
- Storer, C., Daniels, J., Xiao, L., Rossetti, K. Using noninvasive genetic sampling to survey rare butterfly populations. Insects. 10 (10), 311 (2019).
- Wagner, D. L., et al. Insect decline in the Anthropocene: Death by a thousand cuts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (2), 20239891 (2021).
- Montgomery, G. A., et al. Is the insect apocalypse upon us? How to find out. Biological Conservation. 241, 108327 (2020).
