الغشاء المشيمي (CAM) لجنين الطيور هو أداة مفيدة للغاية وقابلة للتطبيق لمختلف مجالات البحث. نموذج خاص من البيضاوي السابق من السمان الياباني CAM مناسب للتحقيق في العلاج الضوئي الديناميكي.
الغشاء المشيمي (CAM) لجنين الطيور هو غشاء رقيق خارج الجنين يعمل كعضو تنفسي أساسي. خصائصه تجعله نموذجا تجريبيا ممتازا في الجسم الحي لدراسة تكوين الأوعية الدموية ، ونمو الورم ، وأنظمة توصيل الأدوية ، أو التشخيص الضوئي الديناميكي (PDD) والعلاج الضوئي الديناميكي (PDT). وفي الوقت نفسه، يتناول هذا النموذج شرط استبدال التجارب ببديل مناسب. يسمح الجنين المزروع ب Ex ovo بسهولة تطبيق المادة والوصول إليها ومراقبتها وتوثيقها. الأكثر استخداما هو CAM الفرخ. ومع ذلك ، تصف هذه المقالة مزايا CAM السمان الياباني كنموذج منخفض التكلفة وعالي الإنتاجية. ميزة أخرى هي التطور الجنيني الأقصر ، والذي يسمح بدوران تجريبي أعلى. يتم استكشاف مدى ملاءمة CAM السمان ل PDD و PDT للسرطان والالتهابات الميكروبية هنا. على سبيل المثال ، يتم وصف استخدام المحسس الضوئي hypericin مع البروتينات الدهنية أو الجسيمات النانوية كنظام توصيل. تم تحديد درجة الضرر من الصور في الضوء الأبيض والتغيرات في شدة التألق لأنسجة CAM تحت الضوء البنفسجي (405 نانومتر) ، جنبا إلى جنب مع تحليل المقاطع النسيجية. أظهر CAM السمان بوضوح تأثير PDT على الأوعية الدموية والأنسجة. علاوة على ذلك ، يمكن ملاحظة تغييرات مثل النزيف الشعري ، والجلطة ، وتحلل الأوعية الصغيرة ، ونزيف الأوعية الكبيرة. يعد CAM للسمان الياباني نموذجا واعدا في الجسم الحي للتشخيص الضوئي الديناميكي وأبحاث العلاج ، مع تطبيقات في دراسات تكوين الأوعية الدموية للورم ، وكذلك العلاج المضاد للأوعية الدموية ومضادات الميكروبات.
نموذج غشاء الدجاج chorioallantoic (CAM) معروف جيدا ويستخدم على نطاق واسع في مختلف مجالات البحث. وهو عضو خارج الجنين غني بالأوعية الدموية يوفر تبادل الغازات ونقل المعادن1. نظرا لشفافية هذا الغشاء وإمكانية الوصول إليه ، يمكن ملاحظة الأوعية الدموية الفردية وتغييراتها الهيكلية في الوقت الفعلي2. على الرغم من المزايا ، فإن CAM الفرخ لديه أيضا بعض القيود (على سبيل المثال ، مرافق تربية أكبر ، وإنتاج البيض ، واستهلاك الأعلاف) التي يمكن تجنبها باستخدام أنواع الطيور الأخرى. في هذا البروتوكول ، يتم وصف نموذج CAM بديل ل ex ovo باستخدام جنين السمان الياباني (Coturnix japonica). نظرا لصغر حجمه ، فإنه يسمح باستخدام عدد أكبر بكثير من الأفراد التجريبيين من CAM الدجاج. علاوة على ذلك ، فإن التطور الجنيني الأقصر لمدة 16 يوما لأجنة السمان هو ميزة أخرى. تظهر أول أوعية أكبر على CAM السمان في اليوم الجنيني (ED) 7. يمكن مقارنة ذلك مباشرة مع تطور جنين الفرخ (المراحل 4-35) ؛ ومع ذلك ، فإن المراحل المتأخرة من التطور لم تعد قابلة للمقارنة وتتطلب وقتا أقل لجنين السمان3. من المثير للاهتمام هو الحدوث المنتظم للتفرع الوعائي الدقيق على غرار الدجاج CAMs 4,5,6. النضج الجنسي السريع ، وارتفاع إنتاج البيض ، والتربية منخفضة التكلفة هي أمثلة أخرى تفضل استخدام هذا النموذج التجريبي7.
غالبا ما يستخدم نموذج CAM للطيور في دراسات العلاج الضوئي الديناميكي (PDT)8. يستخدم PDT لعلاج عدة أشكال من السرطان (الأورام الموضعية الصغيرة) وغيرها من الأمراض غير الورمية. مبدأها هو في توصيل دواء الفلورسنت ، وهو محسس للضوء (PS) ، إلى الأنسجة التالفة وتنشيطه بضوء الطول الموجي المناسب. أحد PS المحتملين المستخدمين في الأبحاث هو hypericin ، المعزول أصلا من نبتة سانت جون الطبية (Hypericum perforatum)9. تعتمد تأثيرات الحساسية الضوئية القوية لهذا المركب على خصائصه الكيميائية الضوئية والفيزيائية الضوئية. تتميز هذه بقمم إثارة التألق المتعددة في نطاق 400-600 نانومتر ، مما يحفز انبعاث التألق عند حوالي 600 نانومتر. الحد الأقصى لامتصاص hypericin داخل النطاق الطيفي هو في نطاق 540-590 نانومتر ، والحد الأقصى للتألق في نطاق 590-640 نانومتر9. لتحقيق هذه التأثيرات الحساسة للضوء ، يتم إثارة hypericin بواسطة ضوء الليزر بطول موجي يبلغ 405 نانومتر بعد الإدارة المحلية10. في وجود الضوء ، يمكن أن يظهر hypericin تأثيرات مبيد للفيروسات ومضاد للتكاثر وسام للخلايا11 ، في حين لا توجد سمية جهازية ، ويتم إطلاقه بسرعة من الكائن الحي. Hypericin هي مادة محبة للدهون تشكل مجاميع غير قابلة للذوبان في الماء وغير فلورية ، وهذا هو السبب في أن عدة أنواع من الناقلات النانوية ، مثل الجسيمات النانوية البوليمرية12,13 أو البروتينات الدهنية عالية ومنخفضة الكثافة (HDL ، LDL) 14,15 ، تستخدم للمساعدة في توصيلها واختراقها في الخلايا. نظرا لأن CAM هو نظام يعاني من نقص المناعة بشكل طبيعي ، يمكن زرع الخلايا السرطانية مباشرة على سطح الغشاء. كما أن النموذج مناسب تماما لتسجيل مدى تلف الأوعية الدموية الناجم عن PDT وفقا لدرجة محددة16,17. يمكن استخدام ضوء أقل كثافة مقارنة ب PDT للتشخيص الضوئي الديناميكي (PDD). تؤدي مراقبة الأنسجة تحت ضوء LED البنفسجي المثير أيضا إلى التنشيط الضوئي للمحسسات الضوئية18،19،20 التي تؤدي إلى انبعاث ضوء الفلورسنت ، ومع ذلك فهي لا توفر طاقة كافية لبدء تفاعل PDT وإتلاف الخلايا. إنه يجعلها أداة جيدة لتصور الورم وتشخيصه أو مراقبة الحرائك الدوائية ل PSs14,15 المستخدمة.
توضح هذه المقالة إعداد فحص CAM للسمان ex ovo مع معدلات البقاء على قيد الحياة أكثر من 80٪. تم تطبيق هذه الثقافة السابقة بنجاح في عدد كبير من التجارب.
لنجاح زراعة البيضة السابقة ، من المهم اتباع البروتوكول أعلاه. علاوة على ذلك ، إذا لم يتم فتح البيض بعناية كافية أو لم تكن هناك رطوبة كافية أثناء الزراعة ، فإن كيس صفار البيض يلتصق بالقشرة وغالبا ما يتمزق. إن بدء زراعة البيضة السابقة في وقت حوالي 60 ساعة من حضانة البيض يضمن ارتفاع مع…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم العمل من قبل VEGA 2/0042/21 و APVV 20-0129. مساهمة V. Huntošová هي نتيجة لتنفيذ المشروع: مجتمع علمي مفتوح للبحوث الحديثة متعددة التخصصات في الطب (اختصار: OPENMED) ، ITMS2014 +: 313011V455 بدعم من البرنامج التشغيلي للبنية التحتية المتكاملة ، بتمويل من ERDF.
6-Well Cell Culture Plate | Sarstedt | 83.392 | Transparent polystyrene, sterile |
CO2 Incubator ESCO CCL-0508 | ESCO, Singapore | CCL-050B-8 | CO2 cell culture incubator |
cryocut Leica CM 1800 | Reichert-Jung, USA | ||
digital camera Canon EOS 6D II | Canon, Japan | ||
diode laser 405 nm | Ocean Optics, USA | ||
DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | dimethyl sulfoxid |
eosin | Sigma-Aldrich | 15086-94-9 | |
ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
fine brush size 2 | Faber-Castell | 281802 | brush for CAM separation and manipulation |
glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
hematoxylin | Sigma-Aldrich | 517-28-2 | |
hypericin | Sigma-Aldrich | 84082-80-4 | |
incubator Bios Midi | Bios Sedl![]() |
Forced draught incubator for initial incubation | |
incubator Memmert IF160 | Memmert, Germany | Forced air circulation incubator for CAM incubation | |
Kaiser slimlite plano, LED light box | Kaiser, Germany | 2453 | Transilluminator |
LED light 405 nm | custom made circular LED light | ||
macro lens Canon MP- E 65 mm f/2.8 | Canon, Japan | ||
microscope Kapa 2000 | Kvant, Slovakia | optical microscope | |
microtome Auxilab 508 | Auxilab, Spain | manual rotary microtome | |
paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | |
Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | parafin medium for tissue embedding |
PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | Phosphate saline buffer |
scissors Castroviejo | Orimed | OR66-108 | micro scissors for CAM separation |
software ImageJ 1.53 | public domain | image processing and analysis program | |
stock solution HDL | Sigma-Aldrich | 437641-10MG | high density lipoproteins |
stock solution LDL | Sigma-Aldrich | 437644-10MG | low density lipoproteins |
Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | Optimal Cutting Temperature Compound 118 mL squeeze bottles |