Wachtel-Chorioallanto-Membran - ein Werkzeug für die photodynamische Diagnose und Therapie
Summary
Die chorioallantoische Membran (CAM) des Vogelembryos ist ein sehr nützliches und anwendbares Werkzeug für verschiedene Forschungsbereiche. Ein spezielles Ex-Ovo-Modell der japanischen Wachtel-CAM eignet sich für die photodynamische Behandlungsuntersuchung.
Abstract
Die chorioallantoische Membran (CAM) eines Vogelembryos ist eine dünne, extraembryonale Membran, die als primäres Atmungsorgan fungiert. Seine Eigenschaften machen es zu einem ausgezeichneten experimentellen In-vivo-Modell zur Untersuchung von Angiogenese, Tumorwachstum, Medikamentenabgabesystemen oder photodynamischer Diagnose (PDD) und photodynamischer Therapie (PDT). Gleichzeitig adressiert dieses Modell die Anforderung, Versuchstiere durch eine geeignete Alternative zu ersetzen. Ex ovo kultivierter Embryo ermöglicht eine einfache Substanzanwendung, den Zugang, die Überwachung und die Dokumentation. Am häufigsten wird chick CAM verwendet; Dieser Artikel beschreibt jedoch die Vorteile der japanischen Wachtel-CAM als kostengünstiges Modell mit hohem Durchsatz. Ein weiterer Vorteil ist die kürzere Embryonalentwicklung, die einen höheren experimentellen Umsatz ermöglicht. Die Eignung von Wachtel-CAM für PDD und PDT von Krebs und mikrobiellen Infektionen wird hier untersucht. Als Beispiel wird die Verwendung des Photosensibilisators Hypericin in Kombination mit Lipoproteinen oder Nanopartikeln als Abgabesystem beschrieben. Der Schadenswert aus Bildern in weißem Licht und Änderungen der Fluoreszenzintensität des CAM-Gewebes unter violettem Licht (405 nm) wurde zusammen mit der Analyse histologischer Schnitte bestimmt. Die Wachtel-CAM zeigte deutlich die Wirkung der PDT auf das Gefäßsystem und das Gewebe. Darüber hinaus konnten Veränderungen wie Kapillarblutungen, Thrombosen, Lyse kleiner Gefäße und Blutungen größerer Gefäße beobachtet werden. Japanische Wachtel-CAM ist ein vielversprechendes In-vivo-Modell für die photodynamische Diagnose und Therapieforschung mit Anwendungen in Studien der Tumorangiogenese sowie der antivaskulären und antimikrobiellen Therapie.
Introduction
Das Modell der Chorioallantoischen Hühnermembran (CAM) ist bekannt und in verschiedenen Forschungsbereichen weit verbreitet. Es ist ein reich vaskularisiertes extraembryonales Organ, das für Gasaustausch und Mineraltransport sorgt1. Durch die Transparenz und Zugänglichkeit dieser Membran können einzelne Blutgefäße und ihre strukturellen Veränderungen in Echtzeit beobachtet werden2. Trotz der Vorteile hat Küken-CAM auch einige Einschränkungen (z. B. größere Zuchtanlagen, Eierproduktion und Futterverbrauch), die durch die Verwendung anderer Vogelarten vermieden werden könnten. In diesem Protokoll wird ein alternatives Ex-Ovo-CAM-Modell mit japanischen Wachtelembryonen (Coturnix japonica) beschrieben. Aufgrund seiner geringen Größe ermöglicht es die Verwendung einer viel größeren Anzahl von experimentellen Individuen als Hühner-CAM. Darüber hinaus ist die kürzere 16-tägige Embryonalentwicklung von Wachtelembryonen ein weiterer Vorteil. Die ersten größeren Gefäße auf Wachtel-CAM erscheinen am Embryonaltag (ED) 7. Dies kann direkt mit der Entwicklung von Hühnerembryonen (Stadien 4-35) verglichen werden; Die späteren Entwicklungsstadien sind jedoch nicht mehr vergleichbar und benötigen weniger Zeit für den Wachtelembryo3. Von Interesse ist das regelmäßige Auftreten von mikrovaskulären Verzweigungen ähnlich denen von Hühner-CAMs 4,5,6. Schnelle sexuelle Reifung, hohe Eierproduktion und kostengünstige Zucht sind weitere Beispiele, die die Verwendung dieses experimentellen Modellsbegünstigen 7.
Ein Vogel-CAM-Modell wird häufig in Studien zur photodynamischen Therapie (PDT) verwendet8. Die PDT wird zur Behandlung verschiedener Krebsformen (kleine lokalisierte Tumore) und anderer nicht-onkologischer Erkrankungen eingesetzt. Sein Prinzip besteht in der Abgabe eines fluoreszierenden Arzneimittels, eines Photosensibilisators (PS), an das geschädigte Gewebe und dessen Aktivierung mit Licht der entsprechenden Wellenlänge. Ein prospektives PS, das in der Forschung verwendet wird, ist Hypericin, das ursprünglich aus der Heilpflanze Johanniskraut (Hypericum perforatum) isoliert wurde9. Die starke photosensibilisierende Wirkung dieser Verbindung beruht auf ihren photochemischen und photophysikalischen Eigenschaften. Diese zeichnen sich durch multiple Fluoreszenzanregungspeaks im Bereich von 400-600 nm aus, die die Emission von Fluoreszenz bei etwa 600 nm induzieren. Die Absorptionsmaxima von Hypericin innerhalb des Spektralbandes liegen im Bereich von 540-590 nm und die Fluoreszenzmaxima im Bereich von 590-640 nm9. Um diese photosensibilisierenden Effekte zu erzielen, wird Hypericin nach lokaler Verabreichung durch Laserlicht bei einer Wellenlänge von 405 nm angeregt10. In Gegenwart von Licht kann Hypericin viruzide, antiproliferative und zytotoxische Wirkungen zeigen11, während keine systemische Toxizität vorliegt, und es wird schnell aus dem Organismus freigesetzt. Hypericin ist eine lipophile Substanz, die wasserunlösliche, nicht fluoreszierende Aggregate bildet, weshalb verschiedene Arten von Nanocarriern, wie polymere Nanopartikel 12,13 oder High- und Low-Density-Lipoproteine (HDL, LDL)14,15, verwendet werden, um seine Abgabe und das Eindringen in die Zellen zu unterstützen. Da CAM ein natürlich immundefizientes System ist, können Tumorzellen direkt auf der Membranoberfläche implantiert werden. Das Modell eignet sich auch gut, um das Ausmaß von PDT-induzierten Gefäßschäden nach einem definierten Score16,17 zu erfassen. Licht mit geringerer Intensität im Vergleich zur PDT kann für die photodynamische Diagnose (PDD) verwendet werden. Die Überwachung des Gewebes unter violetter Anregung LED-Licht führt auch zur Photoaktivierung von Photosensibilisatoren18,19,20, die zu einer Emission von fluoreszierendem Licht führt, aber nicht genug Energie liefert, um eine PDT-Reaktion zu starten und die Zellen zu schädigen. Es macht es zu einem guten Werkzeug für die Tumorvisualisierung und Diagnose oder Überwachung der Pharmakokinetik von verwendeten PSs14,15.
Dieser Artikel beschreibt die Herstellung des Wachtel-Ex-Ovo-CAM-Assays mit Überlebensraten von über 80%. Diese Ex-Ovo-Kultur wurde in einer Vielzahl von Experimenten erfolgreich angewendet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Für einen erfolgreichen Ex-Ovo-Anbau ist es wichtig, das obige Protokoll zu befolgen. Wenn die Eier nicht sorgfältig genug geöffnet werden oder während der Kultivierung nicht genügend Feuchtigkeit vorhanden ist, haftet der Dottersack an der Schale und reißt oft. Der Beginn einer Ex-Ovo-Kultivierung zum Zeitpunkt von ca. 60 h Eiinkubation sichert die hohe Überlebensrate der Embryonen, da sie bereits groß genug sind, um die Handhabung zu überstehen. In den späteren Entwicklungsstadien wird das C…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Arbeit wurde von VEGA 2/0042/21 und APVV 20-0129 unterstützt. Der Beitrag von V. Huntošová ist das Ergebnis der Projektdurchführung: Open scientific community for modern interdisciplinary research in medicine (Akronym: OPENMED), ITMS2014+: 313011V455 unterstützt durch das vom EFRE finanzierte Operationelle Programm Integrierte Infrastruktur.
Materials
| 6-Well Cell Culture Plate | Sarstedt | 83.392 | Transparent polystyrene, sterile |
| CO2 Incubator ESCO CCL-0508 | ESCO, Singapore | CCL-050B-8 | CO2 cell culture incubator |
| cryocut Leica CM 1800 | Reichert-Jung, USA | ||
| digital camera Canon EOS 6D II | Canon, Japan | ||
| diode laser 405 nm | Ocean Optics, USA | ||
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | dimethyl sulfoxid |
| eosin | Sigma-Aldrich | 15086-94-9 | |
| ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| fine brush size 2 | Faber-Castell | 281802 | brush for CAM separation and manipulation |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
| hematoxylin | Sigma-Aldrich | 517-28-2 | |
| hypericin | Sigma-Aldrich | 84082-80-4 | |
| incubator Bios Midi | Bios Sedl any, Czech Republic |
Forced draught incubator for initial incubation | |
| incubator Memmert IF160 | Memmert, Germany | Forced air circulation incubator for CAM incubation | |
| Kaiser slimlite plano, LED light box | Kaiser, Germany | 2453 | Transilluminator |
| LED light 405 nm | custom made circular LED light | ||
| macro lens Canon MP- E 65 mm f/2.8 | Canon, Japan | ||
| microscope Kapa 2000 | Kvant, Slovakia | optical microscope | |
| microtome Auxilab 508 | Auxilab, Spain | manual rotary microtome | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | |
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | parafin medium for tissue embedding |
| PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | Phosphate saline buffer |
| scissors Castroviejo | Orimed | OR66-108 | micro scissors for CAM separation |
| software ImageJ 1.53 | public domain | image processing and analysis program | |
| stock solution HDL | Sigma-Aldrich | 437641-10MG | high density lipoproteins |
| stock solution LDL | Sigma-Aldrich | 437644-10MG | low density lipoproteins |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | Optimal Cutting Temperature Compound 118 mL squeeze bottles |
References
- Nowak-Sliwinska, P., van Beijnum, J. R., van Berkel, M., vanden Bergh, H., Griffioen, A. W. Vascular regrowth following photodynamic therapy in the chicken embryo chorioallantoic membrane. Angiogenesis. 13 (4), 281-292 (2010).
- van Leengoed, H. L. L. M., vander Veen, N., Versteeg, A. A. C., Ouellet, R., van Lier, J. E., Star, W. M. In-vivo photodynamic effects of phthalocyanines in a skin-fold observation chamber model: role of central metal ion and degree of sulfonation. Photochemistry Photobiology. 58 (4), 575-580 (1993).
- Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. R. Developmental stages of the Japanese quail. Journal of Anatomy. 216 (1), 3 (2010).
- De Fouw, D. O., Rizzo, V. J., Steinfeld, R., Feinberg, R. N. Mapping of the microcirculation in the chick chorioallantoic membrane during normal angiogenesis. Microvascular Research. 38 (2), 136-147 (1989).
- Sandau, K., Kurz, H. Modelling of vascular growth processes: a stochastic biophysical approach to embryonic angiogenesis. Journal of Microscopy. 175 (3), 205-213 (1994).
- Kurz, H., Ambrosy, S., Wilting, J., Marmé, D., Christ, B. Proliferation pattern of capillary endothelial cells in chorioallantoic membrane development indicates local growth control, which is counteracted by vascular endothelial growth factor application. Developmental Dynamics. 203 (2), 174-186 (1995).
- Huss, D., Poynter, G., Lansford, R. Japanese quail (Coturnix japonica) as laboratory animal model. Lab Animal. 37 (11), 513-519 (2008).
- Gottfried, V., Lindenbaum, E. S., Kimel, S. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as an in-vivo model for photodynamic therapy. Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 12 (2), 204-207 (1992).
- Miškovský, P. Hypericin – a new antiviral and antitumor photosensitizer: mechanism of action and interaction with biological molecules. Current Drug Targets. 3 (1), 55-84 (2002).
- Čavarga, I., et al. Photodynamic effect of hypericin after topical application in the ex ovo quail chorioallantoic membrane model. Planta Medica. 80 (1), 56-62 (2014).
- Martinez-Poveda, B., Quesada, A. R., Medina, M. A. Hypericin in the dark inhibits key steps of angiogenesis in vitro. Europan Journal of Pharmacology. 516 (2), 97-103 (2005).
- Datta, S., et al. Unravelling the excellent chemical stability and bioavailability of solvent responsive curcumin-loaded 2-ethyl-2-oxazoline-grad-2-(4-dodecyloxyphenyl)- 2-oxazoline copolymer nanoparticles for drug delivery. Biomacromolecules. 19 (7), 2459-2471 (2018).
- Huntošová, V., et al. Alkyl Chain length in poly(2-oxazoline)-based amphiphilic gradient copolymers regulates the delivery of hydrophobic molecules: a case of the biodistribution and the photodynamic activity of the photosensitizer hypericin. Biomacromolecules. 22 (10), 4199-4216 (2021).
- Buríková, M., et al. Hypericin fluorescence kinetics in the presence of low density lipoproteins: study on quail CAM assay for topical delivery. General Physiology and Biophysic. 35 (4), 459-468 (2016).
- Lenkavska, L., et al. Benefits of hypericin transport and delivery by low- and high-density lipoproteins to cancer cells: From in vitro to ex ovo. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 25, 214-224 (2019).
- Rück, A., Böhmler, A., Steiner, R. PDT with TOOKAD studied in the chorioallantoic membrane of fertilized eggs. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 2 (1), 79-90 (2005).
- Gottfried, V., Davidi, R., Averbuj, C., Kimel, S. In vivo damage to chorioallantoic membrane blood vessels by porphycene-induced photodynamic therapy. Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 30 (2-3), 115-121 (1995).
- Buzzá, H. H., Silva, L. V., Moriyama, L. T., Bagnato, V. S., Kurachi, C. Evaluation of vascular effect of Photodynamic Therapy in chorioallantoic membrane using different photosensitizers. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 138, 1-7 (2014).
- Dougherty, T. J., et al. Photodynamic therapy. Journal of the National Cancer Institute. 90, 889-905 (1998).
- Xiang, L., et al. Real-time optoacoustic monitoring of vascular damage during photodynamic therapy treatment of tumor. Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 01400-01408 (2007).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), 2720 (2011).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
- Máčajová, M., Čavarga, I., Sýkorová, M., Valachovič, M., Novotná, V., Bilčík, B. Modulation of angiogenesis by topical application of leptin and high and low molecular heparin using the Japanese quail chorioallantoic membrane model. Saudi Journal of Biological Sciences. 27 (6), 1488-1493 (2020).
- Mangir, N., Dikici, S., Claeyssens, F., MacNeil, S. Using Ex Ovo chick chorioallantoic membrane (CAM) assay to evaluate the biocompatibility and angiogenic response to biomaterials. ACS Biomaterials Science Engineering. 5 (7), 3190-3200 (2019).
- Marshall, K. M., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. C. Evolving applications of the egg: chorioallantoic membrane assay and ex vivo organotypic culture of materials for bone tissue engineering. Journal of Tissue Engineering. 11, 1-25 (2020).
- Merlos Rodrigo, M. A., et al. Extending the applicability of in ovo and ex ovo chicken chorioallantoic membrane assays to study cytostatic activity in neuroblastoma cells. Frontiers in Oncology. 11, 1-10 (2021).
- Meta, M., Kundeková, B., Bilčík, B., Máčajová, M. The effect of silicone ring application on CAM vasculature in Japanese Quail (Coturnix japonica). Proceedings of the Student Scientific Conference Faculty of Natural Sciences of Comenius University, Bratislava, Slovakia. , 385-390 (2019).
- Kohli, N., et al. Pre-screening the intrinsic angiogenic capacity of biomaterials in an optimised ex ovo chorioallantoic membrane model. Journal of Tissue Engineering. 11, 1-15 (2020).
- Kundeková, B., Máčajová, M., Meta, M., Čavarga, I., Bilčík, B. Chorioallantoic membrane models of various avian species differences and applications. Biology-Basel. 10 (4), 301 (2021).
- Parsons-Wingerter, P., Elliott, K. E., Clark, J. I., Farr, A. G. Fibroblast growth factor-2 selectively stimulates angiogenesis of small vessels in arterial tree. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 20 (5), 1250-1256 (2000).
- Buzzá, H. H., Zangirolami, A. C., Davis, A., Gómez-García, P. B., Kurachi, C. Fluorescence analysis of a tumor model in the chorioallantoic membrane used for the evaluation of different photosensitizers for photodynamic therapy. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 19, 78-83 (2017).
