Quail Chorioallantoic membran - et værktøj til fotodynamisk diagnose og terapi

Summary

Den chorioallantoiske membran (CAM) i fugleembryoet er et meget nyttigt og anvendeligt værktøj til forskellige forskningsområder. En særlig ex ovo-model af japansk vagtel CAM er velegnet til fotodynamisk behandlingsundersøgelse.

Abstract

Den chorioallantoiske membran (CAM) i et fugleembryo er en tynd, ekstraembryonal membran, der fungerer som et primært åndedrætsorgan. Dens egenskaber gør det til en fremragende in vivo eksperimentel model til at studere angiogenese, tumorvækst, lægemiddelleveringssystemer eller fotodynamisk diagnose (PDD) og fotodynamisk terapi (PDT). Samtidig imødekommer denne model kravet om udskiftning af forsøgsdyr med et passende alternativ. Ex ovo dyrket embryo giver nem stofpåføring, adgang, overvågning og dokumentation. Den mest anvendte er chick CAM; Denne artikel beskriver dog fordelene ved den japanske vagtel CAM som en billig og høj gennemstrømningsmodel. En anden fordel er den kortere embryonale udvikling, hvilket muliggør højere eksperimentel omsætning. Egnetheden af vagtel CAM til PDD og PDT af kræft og mikrobielle infektioner undersøges her. Som et eksempel beskrives brugen af fotosensibilisatoren hypericin i kombination med lipoproteiner eller nanopartikler som et leveringssystem. Skadesscoren fra billeder i hvidt lys og ændringer i fluorescensintensiteten af CAM-vævet under violet lys (405 nm) blev bestemt sammen med analyse af histologiske sektioner. Vagtel CAM viste tydeligt effekten af PDT på vaskulaturen og vævet. Desuden kunne ændringer som kapillærblødning, trombose, lysis af små kar og blødning af større kar observeres. Japansk vagtel CAM er en lovende in vivo-model til fotodynamisk diagnose og terapiforskning med anvendelser i undersøgelser af tumorangiogenese samt antivaskulær og antimikrobiel terapi.

Introduction

Kylling chorioallantoic membran (CAM) modellen er velkendt og udbredt inden for forskellige forskningsområder. Det er et rigt vaskulariseret ekstraembryonalt organ, der giver gasudveksling og mineraltransport¹. På grund af gennemsigtigheden og tilgængeligheden af denne membran kan individuelle blodkar og deres strukturelle ændringer observeres i realtid². På trods af fordelene har kyllinge-CAM også nogle begrænsninger (f.eks. Større avlsfaciliteter, ægproduktion og foderforbrug), der kunne undgås ved at bruge andre fuglearter. I denne protokol beskrives en alternativ ex ovo CAM-model med japansk vagtel (Coturnix japonica) embryo. På grund af sin lille størrelse tillader det brugen af et meget større antal eksperimentelle individer end kylling CAM. Desuden er den kortere 16-dages embryonale udvikling af vagtelembryoner en anden fordel. De første større fartøjer på vagtel CAM vises på embryonal dag (ED) 7. Dette kan sammenlignes direkte med chick embryo udvikling (trin 4-35); De senere udviklingsstadier er imidlertid ikke længere sammenlignelige og kræver mindre tid til vagtelembryoet³. Af interesse er den regelmæssige forekomst af mikrovaskulær forgrening svarende til kylling CAMs ^4,5,6. Hurtig seksuel modning, høj ægproduktion og billig avl er andre eksempler, der favoriserer brugen af denne eksperimentelle model⁷.

En CAM-model anvendes ofte i fotodynamiske terapiundersøgelser (PDT)⁸. PDT bruges til behandling af flere former for kræft (små lokaliserede tumorer) og andre ikke-onkologiske sygdomme. Dets princip er i levering af et fluorescerende lægemiddel, en fotosensibilisator (PS), til det beskadigede væv og dets aktivering med lys med den passende bølgelængde. En potentiel PS, der anvendes i forskning, er hypericin, oprindeligt isoleret fra lægeplanten St. John’s wort (Hypericum perforatum)⁹. De stærke fotosensibiliserende virkninger af denne forbindelse er baseret på dets fotokemiske og fotofysiske egenskaber. Disse er kendetegnet ved flere fluorescens excitation toppe i området 400-600 nm, hvilket inducerer emission af fluorescens ved ca. 600 nm. Absorptionsmaksima for hypericin inden for spektralbåndet ligger i området 540-590 nm, og fluorescensmaksima ligger i området 590-640 nm⁹. For at opnå disse fotosensibiliserende effekter ophidses hypericin af laserlys ved en bølgelængde på 405 nm efter lokal administration¹⁰. I nærvær af lys kan hypericin udvise virucide, antiproliferative og cytotoksiske virkninger¹¹, mens der ikke er nogen systemisk toksicitet, og det frigives hurtigt fra organismen. Hypericin er et lipofilt stof, der danner vanduopløselige, ikke-fluorescerende aggregater, hvorfor flere typer nanocarriers, såsom polymere nanopartikler 12,13 eller lipoproteiner med høj og lav densitet (HDL, LDL)^14,15, bruges til at hjælpe dets levering og indtrængning i cellerne. Da CAM er et naturligt immundefekt system, kan tumorceller implanteres direkte på membranoverfladen. Modellen er også velegnet til registrering af omfanget af PDT-induceret vaskulær skade i henhold til en defineret score^16,17. Lys med lavere intensitet sammenlignet med PDT kan bruges til fotodynamisk diagnose (PDD). Overvågning af vævet under violet excitation LED-lys fører også til fotoaktivering af fotosensibilisatorer^18,19,20, der resulterer i en emission af fluorescerende lys^, men det giver ikke nok energi til at starte en PDT-reaktion og beskadige cellerne. Det gør det til et godt værktøj til tumorvisualisering og diagnose eller overvågning af farmakokinetikken af brugte PSs^14,15.

Denne artikel beskriver forberedelsen af vagtler ex ovo CAM-assay med overlevelsesrater over 80%. Denne ex ovo-kultur blev anvendt med succes i et stort antal eksperimenter.

Protocol

Forskningen blev udført i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer. Alt udstyr og reagenser skal autoklaveres eller steriliseres med 70% ethanol eller UV-lys. 1. Inkubation af æg Opbefrugtede vagtelæg opbevares ved 10-15 °C i højst 4-5 dage, før inkubationen påbegyndes. Brug kun rene og ubeskadigede æg. Inkuber æggene i en tvungen trækkuvøse i ~ 53-54 timer. Læg æggene vandret med ægrotationen slukket, ved 50% -60% fugtighed og 37,5…

Representative Results

Lokaliseringen af tumoren på CAM-overfladen er vanskelig i hvidt lys. Fotosensibilisator (her hypericin), der anvendes i PDD, forventes at blive optaget selektivt af tumoren og hjælper med at visualisere tumoren. Tilsætningen af hypericin og brugen af fluorescerende lys (f.eks. 405 nm) viste tumorpositionen (pladecellecarcinom TE1) meget godt (figur 6A). Histologisk analyse viste vitale tumorceller, der invaderede sunde væv. Koncentriske strukturer af unormale pladeceller, ofte beskrevet…

Discussion

For en vellykket ex ovo-dyrkning er det vigtigt at følge protokollen ovenfor. Desuden, hvis æggene ikke åbnes omhyggeligt nok, eller der ikke er tilstrækkelig fugtighed under dyrkningen, klæber æggeblommesækken til skallen og brister ofte. Påbegyndelsen af en ex ovo-dyrkning på tidspunktet for ca. 60 timers æginkubation sikrer embryonernes høje overlevelsesrate, da de allerede er store nok til at overleve håndteringen. På de senere udviklingsstadier bliver CAM tyndere og klæber til æggesk…

Materials

6-Well Cell Culture Plate	Sarstedt	83.392	Transparent polystyrene, sterile
CO2 Incubator ESCO CCL-0508	ESCO, Singapore	CCL-050B-8	CO2 cell culture incubator
cryocut Leica CM 1800	Reichert-Jung, USA
digital camera Canon EOS 6D II	Canon, Japan
diode laser 405 nm	Ocean Optics, USA
DMSO	Sigma-Aldrich	67-68-5	dimethyl sulfoxid
eosin	Sigma-Aldrich	15086-94-9
ethanol	Sigma-Aldrich	64-17-5
fine brush size 2	Faber-Castell	281802	brush for CAM separation and manipulation
glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	111-30-8
hematoxylin	Sigma-Aldrich	517-28-2
hypericin	Sigma-Aldrich	84082-80-4
incubator Bios Midi	Bios Sedlany, Czech Republic		Forced draught incubator for initial incubation
incubator Memmert IF160	Memmert, Germany		Forced air circulation incubator for CAM incubation
Kaiser slimlite plano, LED light box	Kaiser, Germany	2453	Transilluminator
LED light 405 nm			custom made circular LED light
macro lens Canon MP- E 65 mm f/2.8	Canon, Japan
microscope Kapa 2000	Kvant, Slovakia		optical microscope
microtome Auxilab 508	Auxilab, Spain		manual rotary microtome
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	30525-89-4
Paraplast Plus	Sigma-Aldrich	P3683	parafin medium for tissue embedding
PBS	Sigma-Aldrich	P4417	Phosphate saline buffer
scissors Castroviejo	Orimed	OR66-108	micro scissors for CAM separation
software ImageJ 1.53	public domain		image processing and analysis program
stock solution HDL	Sigma-Aldrich	437641-10MG	high density lipoproteins
stock solution LDL	Sigma-Aldrich	437644-10MG	low density lipoproteins
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583	Optimal Cutting Temperature Compound 118 mL squeeze bottles