Quail Chorioallantoic Membrane - Et verktøy for fotodynamisk diagnose og terapi

Summary

Den chorioallantoiske membranen (CAM) til fugleembryoet er et svært nyttig og anvendelig verktøy for ulike forskningsområder. En spesiell ex ovo-modell av japansk vaktel CAM er egnet for fotodynamisk behandlingsundersøkelse.

Abstract

Den chorioallantoiske membranen (CAM) til et aviært embryo er en tynn, ekstraembryonisk membran som fungerer som et primært respiratorisk organ. Egenskapene gjør den til en utmerket in vivo eksperimentell modell for å studere angiogenese, tumorvekst, legemiddelleveringssystemer eller fotodynamisk diagnose (PDD) og fotodynamisk terapi (PDT). Samtidig adresserer denne modellen kravet om erstatning av forsøksdyr med et egnet alternativ. Ex ovo dyrket embryo tillater enkel stoffpåføring, tilgang, overvåking og dokumentasjon. Den mest brukte er chick CAM; Denne artikkelen beskriver imidlertid fordelene med den japanske vaktelen CAM som en lavpris- og høykapasitetsmodell. En annen fordel er den kortere embryonale utviklingen, noe som gir høyere eksperimentell omsetning. Egnetheten av vaktel CAM for PDD og PDT av kreft og mikrobielle infeksjoner er utforsket her. Som et eksempel beskrives bruken av fotosensibilisatorhypericin i kombinasjon med lipoproteiner eller nanopartikler som et leveringssystem. Skadeskår fra bilder i hvitt lys og endringer i fluorescensintensitet i CAM-vevet under fiolett lys (405 nm) ble fastslått, sammen med analyse av histologiske snitt. Vaktelen CAM viste tydelig effekten av PDT på vaskulatur og vev. Videre kunne endringer som kapillærblødning, trombose, lysis av små kar og blødning av større kar observeres. Japansk vaktel CAM er en lovende in vivo modell for fotodynamisk diagnose og terapiforskning, med anvendelser i studier av tumorangiogenese, samt antivaskulær og antimikrobiell terapi.

Introduction

Kylling chorioallantoic membran (CAM) modellen er kjent og mye brukt i ulike forskningsområder. Det er et rikt vaskularisert ekstraembryonisk organ som gir gassutveksling og mineraltransport¹. På grunn av gjennomsiktigheten og tilgjengeligheten til denne membranen, kan individuelle blodkar og deres strukturelle endringer observeres i sanntid². Til tross for fordelene har kylling CAM også noen begrensninger (f.eks. Større avlsanlegg, eggproduksjon og fôrforbruk) som kan unngås ved å bruke andre fuglearter. I denne protokollen beskrives en alternativ ex ovo CAM-modell ved bruk av japansk vaktel (Coturnix japonica) embryo. På grunn av sin lille størrelse tillater det bruk av et mye større antall eksperimentelle individer enn kylling CAM. Videre er den kortere 16-dagers embryonale utviklingen av vaktelembryoer en annen fordel. De første større fartøyene på vaktel CAM vises på embryonal dag (ED) 7. Dette kan sammenlignes direkte med kyllingembryoutvikling (trinn 4-35); Imidlertid er de senere utviklingsstadiene ikke lenger sammenlignbare og krever mindre tid for vaktelembryoet³. Av interesse er den vanlige forekomsten av mikrovaskulær forgrening som ligner på kylling CAMs ^4,5,6. Rask kjønnsmodning, høy eggproduksjon og lavprisavl er andre eksempler som favoriserer bruken av denne eksperimentelle modellen⁷.

En aviær CAM-modell brukes ofte i fotodynamisk terapi (PDT) studier⁸. PDT brukes til å behandle flere former for kreft (små lokaliserte svulster) og andre ikke-onkologiske sykdommer. Dens prinsipp er i levering av et fluorescerende stoff, en fotosensibilisator (PS), til det skadede vevet og dets aktivering med lys av riktig bølgelengde. En prospektiv PS som brukes i forskning er hypericin, opprinnelig isolert fra den medisinske planten St. John’s wort (Hypericum perforatum)⁹. De sterke fotosensibiliserende effektene av denne forbindelsen er basert på dens fotokjemiske og fotofysiske egenskaper. Disse er preget av flere fluorescenseksitasjonstopper i området 400-600 nm, noe som induserer utslipp av fluorescens ved ca. 600 nm. Absorpsjonsmaksimumet for hypericin i spektralbåndet er i området 540-590 nm, og fluorescensmaksima er i området 590-640 nm^9. For å oppnå disse fotosensibiliserende effektene, blir hypericin begeistret av laserlys ved en bølgelengde på 405 nm etter lokal administrasjon¹⁰. I nærvær av lys kan hypericin utvise virucidale, antiproliferative og cytotoksiske effekter¹¹, mens det ikke er systemisk toksisitet, og det frigjøres raskt fra organismen. Hypericin er et lipofilt stoff som danner vannuoppløselige, ikke-fluorescerende aggregater, og derfor brukes flere typer nanobærere, for eksempel polymere nanopartikler 12,13 eller lipoproteiner med høy og lav tetthet (HDL, LDL) ^14,15, for å hjelpe levering og penetrasjon i cellene. Siden CAM er et naturlig immunsviktende system, kan tumorceller implanteres direkte på membranoverflaten. Modellen er også godt egnet til å registrere omfanget av PDT-indusert vaskulær skade i henhold til en definert skår^16,17. Lys med lavere intensitet sammenlignet med PDT kan brukes til fotodynamisk diagnose (PDD). Overvåking av vevet under fiolett eksitasjon LED-lys fører også til fotoaktivering av fotosensibilisatorer^18,19,20 som resulterer i utslipp av fluorescerende lys^, men det gir ikke nok energi til å starte en PDT-reaksjon og skade cellene. Det gjør det til et godt verktøy for tumorvisualisering og diagnose eller overvåking av farmakokinetikken til brukt PSs^14,15.

Denne artikkelen beskriver utarbeidelsen av vaktelen ex ovo CAM-analysen med overlevelsesrater over 80%. Denne ex ovo-kulturen ble vellykket brukt i et stort antall eksperimenter.

Protocol

Forskningen ble utført i samsvar med institusjonelle retningslinjer. Alt utstyr og reagenser må autoklaveres eller steriliseres med 70% etanol eller UV-lys. 1. Egg inkubasjon Oppbevar befruktede vaktelegg ved 10-15 °C i maksimalt 4-5 dager før inkubasjonen starter. Bruk bare rene og uskadede egg. Inkuber eggene i en tvungen trekkinkubator i ~ 53-54 timer. Legg eggene horisontalt med eggrotasjonen slått av, ved 50% -60% fuktighet og 37,5 ° C inkubasjon…

Representative Results

Lokaliseringen av svulsten på CAM-overflaten er vanskelig i hvitt lys. Fotosensibilisator (her, hypericin) som brukes i PDD forventes å bli tatt opp selektivt av svulsten og bidrar til å visualisere svulsten. Tillegg av hypericin og bruk av fluorescerende lys (f.eks. 405 nm) viste tumorens (plateepitelkarsinom TE1) posisjon svært godt (figur 6A). Histologisk analyse viste vitale tumorceller som invaderte sunt vev. Konsentriske strukturer av unormale plateepitelceller, ofte beskrevet i pl…

Discussion

For vellykket ex ovo-dyrking er det viktig å følge protokollen ovenfor. Videre, hvis eggene ikke åpnes forsiktig nok eller det ikke er tilstrekkelig fuktighet under dyrking, stikker eggeplommesekken til skallet og brister ofte. Starten på en ex ovo-dyrking på tidspunktet for ca. 60 timers egginkubasjon sikrer den høye overlevelsesgraden til embryoene, da de allerede er store nok til å overleve håndteringen. I de senere utviklingsstadiene blir CAM tynnere og fester seg til eggeskallet, noe som f?…

Materials

6-Well Cell Culture Plate	Sarstedt	83.392	Transparent polystyrene, sterile
CO2 Incubator ESCO CCL-0508	ESCO, Singapore	CCL-050B-8	CO2 cell culture incubator
cryocut Leica CM 1800	Reichert-Jung, USA
digital camera Canon EOS 6D II	Canon, Japan
diode laser 405 nm	Ocean Optics, USA
DMSO	Sigma-Aldrich	67-68-5	dimethyl sulfoxid
eosin	Sigma-Aldrich	15086-94-9
ethanol	Sigma-Aldrich	64-17-5
fine brush size 2	Faber-Castell	281802	brush for CAM separation and manipulation
glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	111-30-8
hematoxylin	Sigma-Aldrich	517-28-2
hypericin	Sigma-Aldrich	84082-80-4
incubator Bios Midi	Bios Sedlany, Czech Republic		Forced draught incubator for initial incubation
incubator Memmert IF160	Memmert, Germany		Forced air circulation incubator for CAM incubation
Kaiser slimlite plano, LED light box	Kaiser, Germany	2453	Transilluminator
LED light 405 nm			custom made circular LED light
macro lens Canon MP- E 65 mm f/2.8	Canon, Japan
microscope Kapa 2000	Kvant, Slovakia		optical microscope
microtome Auxilab 508	Auxilab, Spain		manual rotary microtome
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	30525-89-4
Paraplast Plus	Sigma-Aldrich	P3683	parafin medium for tissue embedding
PBS	Sigma-Aldrich	P4417	Phosphate saline buffer
scissors Castroviejo	Orimed	OR66-108	micro scissors for CAM separation
software ImageJ 1.53	public domain		image processing and analysis program
stock solution HDL	Sigma-Aldrich	437641-10MG	high density lipoproteins
stock solution LDL	Sigma-Aldrich	437644-10MG	low density lipoproteins
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583	Optimal Cutting Temperature Compound 118 mL squeeze bottles