Grootschalige, geautomatiseerde productie van van vetweefsel afgeleide stamcelsferoïden voor 3D-bioprinting
Summary
Hier beschrijven we de grootschalige productie van van vetweefsel afgeleide stromale / stamcel (ASC) sferoïden met behulp van een geautomatiseerd pipetteersysteem om de celsuspensie te zaaien, waardoor homogeniteit van sferoïde grootte en vorm wordt gegarandeerd. Deze ASC-sferoïden kunnen worden gebruikt als bouwstenen voor 3D-bioprintingbenaderingen.
Abstract
Vet-afgeleide stromale / stamcellen (ASC’s) zijn een subpopulatie van cellen gevonden in de stromale vasculaire fractie van menselijk subcutaan vetweefsel erkend als een klassieke bron van mesenchymale stromale / stamcellen. Er zijn veel studies gepubliceerd met ASC’s voor op steigers gebaseerde tissue engineering-benaderingen, die voornamelijk het gedrag van deze cellen onderzochten na hun zaaien op bioactieve steigers. Er zijn echter steigervrije benaderingen in opkomst om weefsels in vitro en in vivo te engineeren, voornamelijk door sferoïden te gebruiken, om de beperkingen van op steigers gebaseerde benaderingen te overwinnen.
Sferoïden zijn 3D-microtissues gevormd door het zelfassemblageproces. Ze kunnen de architectuur en micro-omgeving van inheemse weefsels beter nabootsen, voornamelijk door de vergroting van cel-tot-cel en cel-tot-extracellulaire matrixinteracties. Onlangs worden sferoïden voornamelijk onderzocht als ziektemodellen, medicijnscreeningstudies en bouwstenen voor 3D-bioprinting. Voor 3D-bioprintbenaderingen zijn echter talrijke sferoïden, homogeen in grootte en vorm, nodig om complexe weefsel- en orgaanmodellen te biofabriceren. Bovendien, wanneer sferoïden automatisch worden geproduceerd, is er weinig kans op microbiologische besmetting, waardoor de reproduceerbaarheid van de methode toeneemt.
De grootschalige productie van sferoïden wordt beschouwd als de eerste verplichte stap voor het ontwikkelen van een biofabricagelijn, die doorgaat in het 3D-bioprintproces en eindigt in de volledige rijping van het weefselconstruct in bioreactoren. Het aantal studies dat de grootschalige ASC-sferoïdenproductie onderzocht, is echter nog steeds schaars, samen met het aantal studies dat ASC-sferoïden gebruikte als bouwstenen voor 3D-bioprinting. Daarom is dit artikel bedoeld om de grootschalige productie van ASC-sferoïden te laten zien met behulp van een niet-klevende micromolded hydrogel-techniek die ASC-sferoïden verspreidt als bouwstenen voor 3D-bioprintbenaderingen.
Introduction
Sferoïden worden beschouwd als een steigervrije benadering in tissue engineering. ASC’s zijn in staat om sferoïden te vormen door het zelfassemblageproces. De 3D-microarchitectuur van de sferoïde verhoogt het regeneratieve potentieel van ASC’s, inclusief de differentiatiecapaciteit in meerdere afstammingslijnen 1,2,3. Deze onderzoeksgroep heeft gewerkt met ASC-sferoïden voor kraakbeen- en botweefseltechnologie 4,5,6. Wat nog belangrijker is, sferoïden worden beschouwd als bouwstenen in de biofabricage van weefsels en organen, voornamelijk vanwege hun fusiecapaciteit.
Het gebruik van sferoïden voor weefselvorming hangt af van drie hoofdpunten: (1) de ontwikkeling van gestandaardiseerde en schaalbare robotmethoden voor hun biofabricage7, (2) de systematische fenotypering van weefselsferoïden8, (3) de ontwikkeling van methoden voor de assemblage van 3D-weefsels9. Deze sferoïden kunnen worden gevormd met verschillende celtypen en worden verkregen via verschillende methoden, waaronder hanging drop, reaggregatie, microfluïdica en micromol 8,9,10. Elk van deze methoden heeft voor- en nadelen met betrekking tot de homogeniteit van grootte en vorm van de sferoïden, het herstel van de sferoïden na formatie, het aantal geproduceerde sferoïden, procesautomatisering, arbeidsintensiteit en kosten11.
Bij de micromoldmethode worden de cellen vanwege de zwaartekracht op de bodem van de micromol gedoseerd en afgezet. De niet-klevende hydrogel laat de cellen zich niet aan de bodem hechten en cel-tot-cel interacties leiden tot de vorming van een enkele sferoïde per recessie 8,12. Deze biofabricagemethode genereert sferoïden van homogene en gecontroleerde grootte, kan worden gerobotiseerd voor grootschalige productie op een tijdsefficiënte manier met minimale inspanning en heeft goede kosteneffectiviteitskritische factoren bij het ontwerp van een biofabricage van weefselsferoïde 7,8. Deze methode kan worden toegepast om sferoïden van elke cellijn te vormen om een nieuw weefseltype voor te bereiden met voorspelbare, optimale en controleerbare kenmerken8.
Biofabricage wordt gedefinieerd als “de geautomatiseerde generatie van biologisch functionele producten met structurele organisatie …”13. Daarom wordt de geautomatiseerde productie van sferoïden beschouwd als de eerste verplichte stap voor het ontwikkelen van een biofabricagelijn, die doorgaat in het 3D-bioprintproces en eindigt in de volledige rijping van het biogeprinte weefsel door sferoïde fusie. In deze studie, om de schaalbaarheid van ASC sferoïde biofabricage te verbeteren, gebruiken we een geautomatiseerd pipetteersysteem om de celsuspensie te zaaien, waardoor de homogeniteit van de grootte en vorm van de sferoïde wordt gewaarborgd. Dit artikel toont aan dat het mogelijk was om een groot aantal (duizenden) sferoïden te produceren die nodig zijn voor 3D-bioprintingbenaderingen om complexere weefselmodellen te biofabriceren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit artikel presenteert de grootschalige generatie ASC-sferoïden met behulp van een geautomatiseerd pipetsysteem. De kritieke stap van het protocol is om de software nauwkeurig in te stellen om het juiste volume van celsuspensie, snelheid en afstand voor pipetteren te garanderen. De parameters beschreven in het protocol werden bepaald na een aantal proeven om de afgifte van de ASC-celsuspensie in de putten van 12-well platen met de micromolded, niet-adherente hydrogels te optimaliseren. De optimalisatie werd geëvalueer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken het Nationaal Instituut voor Metrologie, Kwaliteit en Technologie (INMETRO, RJ, Brazilië) voor het gebruik van hun faciliteiten. Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door de Carlos Chagas Filho Foundation for Research Support of the State of Rio de Janeiro (Faperj) (finance Code: E26/202.682/2018 en E-26/010.001771/2019), de National Council for Scientific and Technological Development (CNPq) (finance code: 307460/2019-3) en het Office of Naval Research (ONR) (finance code: N62909-21-1-2091). Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het National Center of Science and Technology on Regenerative Medicine-INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/).
Materials
| 12-well plastic plate | Corning | 3512 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | CLS430828 | |
| EpMotion 5070 | Eppendorf | 5070000282 | |
| epT.I.P.S. Motion | Eppendorf | 30015231 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15576028 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) | Gibco | 31600034 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids – 16 x 16 array | Sigma | Z764000 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids – 9 x 9 array | Sigma | Z764019 | |
| phosphate saline buffer (PBS) | Sigma | 806552 | |
| sodium chloride (NaCl) | Sigma | S8776 | |
| tissue culture flask | Corning | 430720U | |
| trypan | Lonza | 17-942E | |
| trypsin | Gibco | 27250018 | |
| ultrapure agarose | Invitrogen | 16500100 |
References
- Gentile, C. Filling the gaps between the in vivo and in vitro microenvironment: Engineering of spheroids for stem cell technology. Current Stem Cell Research & Therapy. 11 (8), 652-665 (2016).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C: Methods. 16 (4), 735-749 (2009).
- Cortês, I., et al. A scaffold- and serum-free method to mimic human stable cartilage validated by secretome. Tissue Engineering: Part A. 27 (5-6), 311-327 (2021).
- Kronemberger, G. S., et al. Scaffold- and serum-free hypertrophic cartilage tissue engineering as an alternative approach for bone repair. Artificial Organs. 44 (7), 288-299 (2020).
- Kronemberger, G. S., et al. The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication. Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).
- Mehesz, A. N., et al. Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids. Biofabrication. 3 (2), 025002 (2011).
- Koudan, E. V., et al. The scalable standardized biofabrication of tissue spheroids from different cell types using nonadhesive technology. 3D Printing and Additive Manufacturing. 4 (1), 53-60 (2017).
- Parfenov, V. A., et al. label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly. Biofabrication. 10 (3), 034104 (2018).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
- Gutzweiler, L., et al. Large scale production and controlled deposition of single HUVEC spheroids for bioprinting applications. Biofabrication. 9 (2), 025027 (2017).
- Lin, H., Li, Q., Lei, Y. Three-dimensional tissues using human pluripotent stem cell spheroids as biofabrication building blocks. Biofabrication. 9 (2), 025007 (2017).
- Groll, J., et al. Biofabrication: reappraising the definition of an evolving field. Biofabrication. 8 (1), 013001 (2016).
- Baptista, L. S., et al. An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples. Cytotherapy. 11 (6), 706-715 (2009).
- Conway, M. K., et al. Scalable 96-well plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (99), e52755 (2015).
- Moutsatsou, P., et al. Automation in cell and gene therapy manufacturing: from past to future. Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).
- Doulgkeroglou, M. -. K., et al. Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).
- Bhise, N. S., et al. A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids. Biofabrication. 8 (1), 014101 (2016).
- Daly, A. C., Kelly, D. J. Biofabrication of spatially organised tissues by directing the growth of cellular spheroids within 3D printed polymeric microchambers. Biomaterials. 197, 194-206 (2019).
- Lopa, S., et al. Microfluidic biofabrication of 3D multicellular spheroids by modulation of non-geometrical parameters. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 366 (2020).
- Meseguer-Ripolles, J., Kasarinaite, A., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Protocol for automated production of human stem cell derived liver spheres. STAR Protocols. 2 (2), 100502 (2021).
- Lee, G. -. H., Suh, Y., Park, J. Y. A paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55548 (2018).
- Becerra, D., Wu, T., Jeffs, S., Ott, H. C. High-throughput culture method of induced pluripotent stem cell-derived alveolar epithelial cells. Tissue Engineering Part C – Methods. 27 (12), 639-648 (2021).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line. Current Opinion Biotechnology. 22 (5), 667-673 (2011).
- De Moor, L., et al. High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting. Biofabrication. 10 (3), 035009 (2018).
