Produzione automatizzata su larga scala di sferoidi a cellule staminali di derivazione adiposa per la bioprinting 3D
Summary
Qui, descriviamo la produzione su larga scala di sferoidi stromali / cellule staminali (ASC) di derivazione adiposa utilizzando un sistema di pipettaggio automatizzato per seminare la sospensione cellulare, garantendo così l’omogeneità delle dimensioni e della forma dello sferoide. Questi sferoidi ASC possono essere utilizzati come elementi costitutivi per approcci di bioprinting 3D.
Abstract
Le cellule stromali/staminali di derivazione adiposa (ASC) sono una sottopopolazione di cellule presenti nella frazione vascolare stromale del tessuto adiposo sottocutaneo umano riconosciuta come fonte classica di cellule stromali/staminali mesenchimali. Molti studi sono stati pubblicati con ASC per approcci di ingegneria tissutale basati su scaffold, che hanno esplorato principalmente il comportamento di queste cellule dopo la loro semina su scaffold bioattivi. Tuttavia, stanno emergendo approcci senza impalcature per ingegnerizzare i tessuti in vitro e in vivo, principalmente utilizzando sferoidi, per superare i limiti degli approcci basati su scaffold.
Gli sferoidi sono microtessuti 3D formati dal processo di auto-assemblaggio. Possono imitare meglio l’architettura e il microambiente dei tessuti nativi, principalmente a causa dell’ingrandimento delle interazioni cellula-cellula e cellula-cellula-matrice extracellulare. Recentemente, gli sferoidi vengono esplorati principalmente come modelli di malattia, studi di screening farmacologico e elementi costitutivi per la bioprinting 3D. Tuttavia, per gli approcci di bioprinting 3D, sono necessari numerosi sferoidi, omogenei per dimensioni e forma, per biofabbricare modelli complessi di tessuti e organi. Inoltre, quando gli sferoidi vengono prodotti automaticamente, ci sono poche possibilità di contaminazione microbiologica, aumentando la riproducibilità del metodo.
La produzione su larga scala di sferoidi è considerata il primo passo obbligatorio per lo sviluppo di una linea di biofabbricazione, che continua nel processo di bioprinting 3D e termina nella piena maturazione del costrutto tissutale nei bioreattori. Tuttavia, il numero di studi che hanno esplorato la produzione di sferoidi ASC su larga scala sono ancora scarsi, insieme al numero di studi che hanno utilizzato gli sferoidi ASC come elementi costitutivi per la bioprinting 3D. Pertanto, questo articolo mira a mostrare la produzione su larga scala di sferoidi ASC utilizzando una tecnica di idrogel microstampato non adesiva che diffonde sferoidi ASC come elementi costitutivi per approcci di bioprinting 3D.
Introduction
Gli sferoidi sono considerati un approccio privo di impalcature nell’ingegneria tissutale. Gli ASC sono in grado di formare sferoidi dal processo di auto-assemblaggio. La microarchitettura 3D dello sferoide aumenta il potenziale rigenerativo delle ASC, compresa la capacità di differenziazione in più lignaggi 1,2,3. Questo gruppo di ricerca ha lavorato con sferoidi ASC per l’ingegneria della cartilagine e del tessuto osseo 4,5,6. Ancora più importante, gli sferoidi sono considerati elementi costitutivi nella biofabbricazione di tessuti e organi, principalmente a causa della loro capacità di fusione.
L’uso di sferoidi per la formazione dei tessuti dipende da tre punti principali: (1) lo sviluppo di metodi robotici standardizzati e scalabili per la loro biofabbricazione7, (2) la fenotipizzazione sistematica degli sferoidi tissutali8, (3) lo sviluppo di metodi per l’assemblaggio di tessuti 3D9. Questi sferoidi possono essere formati con diversi tipi di cellule e ottenuti attraverso vari metodi, tra cui hanging drop, reaggregazione, microfluidica e micromole 8,9,10. Ognuno di questi metodi presenta vantaggi e svantaggi legati all’omogeneità delle dimensioni e della forma degli sferoidi, al recupero degli sferoidi dopo la formazione, al numero di sferoidi prodotti, all’automazione del processo, all’intensità del lavoro e ai costi11.
Nel metodo micromold, le cellule vengono erogate e depositate sul fondo del micromold a causa della gravità. L’idrogel non adesivo non consente alle cellule di aderire al fondo e le interazioni cellula-cellula portano alla formazione di un singolo sferoide per recessione 8,12. Questo metodo di biofabbricazione genera sferoidi di dimensioni omogenee e controllate, può essere robotizzato per la produzione su larga scala in modo efficiente in termini di tempo con il minimo sforzo e ha buoni fattori critici in termini di economicità nella progettazione di una biofabbricazione di tessuto sferoide 7,8. Questo metodo può essere applicato per formare sferoidi di qualsiasi lignaggio cellulare per preparare un nuovo tipo di tessuto con caratteristiche prevedibili, ottimali e controllabili8.
La biofabbricazione è definita come “la generazione automatizzata di prodotti biologicamente funzionali con organizzazione strutturale …”13. Pertanto, la produzione automatizzata di sferoidi è considerata il primo passo obbligatorio per lo sviluppo di una linea di biofabbricazione, che continua nel processo di bioprinting 3D e termina nella piena maturazione del tessuto biostampato mediante fusione sferoide. In questo studio, per migliorare la scalabilità della biofabbricazione sferoide ASC, utilizziamo un sistema di pipettaggio automatizzato per seminare la sospensione cellulare, garantendo così l’omogeneità delle dimensioni e della forma dello sferoide. Questo documento mostra che è stato possibile produrre un gran numero (migliaia) di sferoidi necessari per gli approcci di bioprinting 3D per biofabbricare modelli di tessuto più complessi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo documento presenta la generazione su larga scala di sferoidi ASC utilizzando un sistema di pipette automatizzato. Il passaggio critico del protocollo è quello di impostare con precisione il software per garantire il corretto volume di sospensione della cella, la velocità e la distanza per il pipettaggio. I parametri descritti nel protocollo sono stati determinati dopo una serie di prove per ottimizzare l’erogazione della sospensione cellulare ASC nei pozzetti di piastre a 12 pozzetti contenenti gli idrogel micro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo l’Istituto Nazionale di Metrologia, Qualità e Tecnologia (INMETRO, RJ, Brasile) per l’utilizzo delle loro strutture. Questo studio è stato parzialmente sostenuto dalla Fondazione Carlos Chagas Filho per il sostegno alla ricerca dello Stato di Rio de Janeiro (Faperj) (Codice finanziario: E26/202.682/2018 e E-26/010.001771/2019), dal Consiglio nazionale per lo sviluppo scientifico e tecnologico (CNPq) (codice finanziario: 307460/2019-3) e dall’Ufficio di ricerca navale (ONR) (codice finanziario: N62909-21-1-2091). Questo lavoro è stato parzialmente supportato dal National Center of Science and Technology on Regenerative Medicine-INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/).
Materials
| 12-well plastic plate | Corning | 3512 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | CLS430828 | |
| EpMotion 5070 | Eppendorf | 5070000282 | |
| epT.I.P.S. Motion | Eppendorf | 30015231 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15576028 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) | Gibco | 31600034 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids – 16 x 16 array | Sigma | Z764000 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids – 9 x 9 array | Sigma | Z764019 | |
| phosphate saline buffer (PBS) | Sigma | 806552 | |
| sodium chloride (NaCl) | Sigma | S8776 | |
| tissue culture flask | Corning | 430720U | |
| trypan | Lonza | 17-942E | |
| trypsin | Gibco | 27250018 | |
| ultrapure agarose | Invitrogen | 16500100 |
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