3 डी बायोप्रिंटिंग के लिए वसा-व्युत्पन्न स्टेम सेल स्फेरॉइड का बड़े पैमाने पर, स्वचालित उत्पादन
Summary
स्टेम सेल (एएससी) स्फेरॉइड के बड़े पैमाने पर उत्पादन का वर्णन करते हैं, जो सेल निलंबन को बीज करने के लिए एक स्वचालित पाइपिंग सिस्टम का उपयोग करते हैं, इस प्रकार गोलाकार आकार और आकार की एकरूपता सुनिश्चित करते हैं। इन एएससी स्फेरॉइड का उपयोग 3 डी बायोप्रिंटिंग दृष्टिकोण के लिए बिल्डिंग ब्लॉक के रूप में किया जा सकता है।
Abstract
स्टेम कोशिकाएं (एएससी) मानव चमड़े के नीचे के वसा ऊतक के स्ट्रोमल संवहनी अंश में पाई जाने वाली कोशिकाओं की एक उप-जनसंख्या है जिसे मेसेनकाइमल स्ट्रोमल / स्टेम कोशिकाओं के शास्त्रीय स्रोत के रूप में मान्यता प्राप्त है। पाड़-आधारित ऊतक इंजीनियरिंग दृष्टिकोणों के लिए एएससी के साथ कई अध्ययन प्रकाशित किए गए हैं, जिन्होंने मुख्य रूप से बायोएक्टिव मचानों पर उनके बोने के बाद इन कोशिकाओं के व्यवहार का पता लगाया। हालांकि, मचान-मुक्त दृष्टिकोण इन विट्रो और विवो में ऊतकों को इंजीनियर करने के लिए उभर रहे हैं, मुख्य रूप से स्फेरॉइड का उपयोग करके, मचान-आधारित दृष्टिकोणों की सीमाओं को दूर करने के लिए।
स्फेरॉइड स्व-असेंबली प्रक्रिया द्वारा गठित 3 डी माइक्रोटिस्यू हैं। वे देशी ऊतकों की वास्तुकला और सूक्ष्म वातावरण की बेहतर नकल कर सकते हैं, मुख्य रूप से सेल-टू-सेल और सेल-टू-एक्सट्रासेल्युलर मैट्रिक्स इंटरैक्शन के आवर्धन के कारण। हाल ही में, स्फेरॉइड को मुख्य रूप से रोग मॉडल, ड्रग स्क्रीनिंग अध्ययन और 3 डी बायोप्रिंटिंग के लिए बिल्डिंग ब्लॉक्स के रूप में खोजा जा रहा है। हालांकि, 3 डी बायोप्रिंटिंग दृष्टिकोण के लिए, कई स्फेरॉइड, आकार और आकार में सजातीय, जटिल ऊतक और अंग मॉडल को बायोफैब्रिकेट करने के लिए आवश्यक हैं। इसके अलावा, जब स्फेरॉइड स्वचालित रूप से उत्पादित होते हैं, तो सूक्ष्मजीवविज्ञानी संदूषण के लिए बहुत कम मौका होता है, जिससे विधि की प्रजनन क्षमता बढ़ जाती है।
स्फेरॉइड के बड़े पैमाने पर उत्पादन को बायोफैब्रिकेशन लाइन विकसित करने के लिए पहला अनिवार्य कदम माना जाता है, जो 3 डी बायोप्रिंटिंग प्रक्रिया में जारी रहता है और बायोरिएक्टरों में ऊतक निर्माण की पूर्ण परिपक्वता में समाप्त होता है। हालांकि, बड़े पैमाने पर एएससी गोलाकार उत्पादन का पता लगाने वाले अध्ययनों की संख्या अभी भी दुर्लभ है, साथ ही उन अध्ययनों की संख्या के साथ जो 3 डी बायोप्रिंटिंग के लिए बिल्डिंग ब्लॉक्स के रूप में एएससी स्फेरॉइड का उपयोग करते थे। इसलिए, इस लेख का उद्देश्य 3 डी बायोप्रिंटिंग दृष्टिकोण के लिए बिल्डिंग ब्लॉक के रूप में एएससी स्फेरॉइड फैलाने वाली गैर-चिपकने वाली माइक्रोमोल्ड हाइड्रोगेल तकनीक का उपयोग करके एएससी स्फेरॉइड के बड़े पैमाने पर उत्पादन को दिखाना है।
Introduction
स्फेरॉइड को ऊतक इंजीनियरिंग में एक मचान मुक्त दृष्टिकोण माना जाता है। एएससी स्व-असेंबली प्रक्रिया द्वारा स्फेरॉइड बनाने में सक्षम हैं। स्फेरॉइड का 3 डी माइक्रोआर्किटेक्चर एएससी की पुनर्योजी क्षमता को बढ़ाता है, जिसमें कई वंशों 1,2,3 में भेदभाव क्षमता शामिल है। यह शोध समूह उपास्थि और हड्डी ऊतक इंजीनियरिंग 4,5,6 के लिए एएससी स्फेरॉइड के साथ काम कर रहा है। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि स्फेरॉइड को ऊतकों और अंगों के बायोफैब्रिकेशन में बिल्डिंग-ब्लॉक माना जाता है, मुख्य रूप से उनकी संलयन क्षमता के कारण।
ऊतक गठन के लिए स्फेरॉइड का उपयोग तीन मुख्य बिंदुओं पर निर्भर करता है: (1) उनके बायोफैब्रिकेशन के लिए मानकीकृत और स्केलेबल रोबोट विधियों का विकास7, (2) ऊतक स्फेरॉइड के व्यवस्थित फेनोटाइपिंग8, (3) 3 डी ऊतकों की विधानसभा के तरीकों का विकास9. इन स्फेरॉइड्स को विभिन्न सेल प्रकारों के साथ बनाया जा सकता है और विभिन्न तरीकों से प्राप्त किया जा सकता है, जिसमें हैंगिंग ड्रॉप, रीएग्रीगेशन, माइक्रोफ्लुइडिक्स और माइक्रोमोल्ड्स 8,9,10 शामिल हैं। इन विधियों में से प्रत्येक में स्फेरॉइड के आकार और आकार की एकरूपता, गठन के बाद स्फेरॉइड की वसूली, उत्पादित स्फेरॉइड की संख्या, प्रक्रिया स्वचालन, श्रम तीव्रता और लागत11 से संबंधित फायदे और नुकसान हैं।
माइक्रोमोल्ड विधि में, कोशिकाओं को गुरुत्वाकर्षण के कारण माइक्रोमोल्ड के तल पर वितरित और जमा किया जाता है। गैर-चिपकने वाला हाइड्रोगेल कोशिकाओं को नीचे का पालन करने की अनुमति नहीं देता है, और सेल-टू-सेल इंटरैक्शन प्रति मंदी 8,12 में एक एकल गोलाकार के गठन की ओर जाता है। यह बायोफैब्रिकेशन विधि सजातीय और नियंत्रित आकार के स्फेरॉइड उत्पन्न करती है, न्यूनतम प्रयास के साथ समय-कुशल तरीके से बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए रोबोट किया जा सकता है, और ऊतक स्फेरॉइड 7,8 के बायोफैब्रिकेशन के डिजाइन में अच्छी लागत-प्रभावशीलता-महत्वपूर्ण कारक हैं। इस विधि को अनुमानित, इष्टतम और नियंत्रणीय विशेषताओं के साथ एक नया ऊतक प्रकार तैयार करने के लिए किसी भी सेल वंश के स्फेरॉइड बनाने के लिए लागू किया जा सकता है8.
बायोफैब्रिकेशन को “संरचनात्मक संगठन के साथ जैविक रूप से कार्यात्मक उत्पादों की स्वचालित पीढ़ी के रूप में परिभाषित किया गया है …” 13. इसलिए, स्फेरॉइड के स्वचालित उत्पादन को बायोफैब्रिकेशन लाइन विकसित करने के लिए पहला अनिवार्य कदम माना जाता है, जो 3 डी बायोप्रिंटिंग प्रक्रिया में जारी रहता है और स्फेरॉइड संलयन द्वारा बायोप्रिंटेड ऊतक की पूर्ण परिपक्वता में समाप्त होता है। इस अध्ययन में, एएससी गोलाकार बायोफैब्रिकेशन की मापनीयता में सुधार करने के लिए, हम सेल निलंबन को बीज करने के लिए एक स्वचालित पाइपिंग प्रणाली का उपयोग करते हैं, इस प्रकार गोलाकार आकार और आकार की एकरूपता सुनिश्चित करते हैं। इस पेपर से पता चलता है कि बायोफैब्रिकेट अधिक जटिल ऊतक मॉडल के लिए 3 डी बायोप्रिंटिंग दृष्टिकोण के लिए आवश्यक बड़ी संख्या (हजारों) स्फेरॉइड का उत्पादन करना संभव था।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह पेपर एक स्वचालित पिपेट सिस्टम का उपयोग करके एएससी स्फेरॉइड की बड़े पैमाने पर पीढ़ी प्रस्तुत करता है। प्रोटोकॉल का महत्वपूर्ण कदम पाइपिंग के लिए सेल निलंबन, गति और दूरी की सही मात्रा सुनिश्चित करने …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ मेट्रोलॉजी, क्वालिटी एंड टेक्नोलॉजी (इनमेट्रो, आरजे, ब्राजील) को उनकी सुविधाओं के उपयोग के लिए धन्यवाद देते हैं। यह अध्ययन आंशिक रूप से रियो डी जनेरियो राज्य (फेपरज) के अनुसंधान समर्थन के लिए कार्लोस चगास फिल्हो फाउंडेशन द्वारा समर्थित था (वित्त संहिता: ई 26 / 202.682/2018 और ई -26 / 010.001771/2019, वैज्ञानिक और तकनीकी विकास के लिए राष्ट्रीय परिषद (सीएनपीक्यू) (वित्त कोड: 307460/2019-3), और नौसेना अनुसंधान कार्यालय यह काम आंशिक रूप से पुनर्योजी चिकित्सा-आईएनसीटी रेजेनेरा (http://www.inctregenera.org.br/) पर विज्ञान और प्रौद्योगिकी के राष्ट्रीय केंद्र द्वारा समर्थित था।
Materials
| 12-well plastic plate | Corning | 3512 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | CLS430828 | |
| EpMotion 5070 | Eppendorf | 5070000282 | |
| epT.I.P.S. Motion | Eppendorf | 30015231 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15576028 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) | Gibco | 31600034 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids – 16 x 16 array | Sigma | Z764000 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids – 9 x 9 array | Sigma | Z764019 | |
| phosphate saline buffer (PBS) | Sigma | 806552 | |
| sodium chloride (NaCl) | Sigma | S8776 | |
| tissue culture flask | Corning | 430720U | |
| trypan | Lonza | 17-942E | |
| trypsin | Gibco | 27250018 | |
| ultrapure agarose | Invitrogen | 16500100 |
References
- Gentile, C. Filling the gaps between the in vivo and in vitro microenvironment: Engineering of spheroids for stem cell technology. Current Stem Cell Research & Therapy. 11 (8), 652-665 (2016).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C: Methods. 16 (4), 735-749 (2009).
- Cortês, I., et al. A scaffold- and serum-free method to mimic human stable cartilage validated by secretome. Tissue Engineering: Part A. 27 (5-6), 311-327 (2021).
- Kronemberger, G. S., et al. Scaffold- and serum-free hypertrophic cartilage tissue engineering as an alternative approach for bone repair. Artificial Organs. 44 (7), 288-299 (2020).
- Kronemberger, G. S., et al. The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication. Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).
- Mehesz, A. N., et al. Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids. Biofabrication. 3 (2), 025002 (2011).
- Koudan, E. V., et al. The scalable standardized biofabrication of tissue spheroids from different cell types using nonadhesive technology. 3D Printing and Additive Manufacturing. 4 (1), 53-60 (2017).
- Parfenov, V. A., et al. label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly. Biofabrication. 10 (3), 034104 (2018).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
- Gutzweiler, L., et al. Large scale production and controlled deposition of single HUVEC spheroids for bioprinting applications. Biofabrication. 9 (2), 025027 (2017).
- Lin, H., Li, Q., Lei, Y. Three-dimensional tissues using human pluripotent stem cell spheroids as biofabrication building blocks. Biofabrication. 9 (2), 025007 (2017).
- Groll, J., et al. Biofabrication: reappraising the definition of an evolving field. Biofabrication. 8 (1), 013001 (2016).
- Baptista, L. S., et al. An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples. Cytotherapy. 11 (6), 706-715 (2009).
- Conway, M. K., et al. Scalable 96-well plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (99), e52755 (2015).
- Moutsatsou, P., et al. Automation in cell and gene therapy manufacturing: from past to future. Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).
- Doulgkeroglou, M. -. K., et al. Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).
- Bhise, N. S., et al. A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids. Biofabrication. 8 (1), 014101 (2016).
- Daly, A. C., Kelly, D. J. Biofabrication of spatially organised tissues by directing the growth of cellular spheroids within 3D printed polymeric microchambers. Biomaterials. 197, 194-206 (2019).
- Lopa, S., et al. Microfluidic biofabrication of 3D multicellular spheroids by modulation of non-geometrical parameters. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 366 (2020).
- Meseguer-Ripolles, J., Kasarinaite, A., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Protocol for automated production of human stem cell derived liver spheres. STAR Protocols. 2 (2), 100502 (2021).
- Lee, G. -. H., Suh, Y., Park, J. Y. A paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55548 (2018).
- Becerra, D., Wu, T., Jeffs, S., Ott, H. C. High-throughput culture method of induced pluripotent stem cell-derived alveolar epithelial cells. Tissue Engineering Part C – Methods. 27 (12), 639-648 (2021).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line. Current Opinion Biotechnology. 22 (5), 667-673 (2011).
- De Moor, L., et al. High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting. Biofabrication. 10 (3), 035009 (2018).
