טכניקה כירורגית מותאמת להשתלת כליה בעכברים
Summary
פרוטוקול זה מציג טכניקה כירורגית חדשה של השתלת כליה של עכברים המתמקדת באסטרטגיית אנסטומוזיס עורקית שונה. כמו כן מוצגת טכניקת תפר כלי דם הכוללת שיטת אנסטומוזה פשוטה ובטוחה יותר של השופכן-שלפוחית השתן. שינויים אלה מקצרים את זמן הניתוח ומשפרים את שיעור ההצלחה של הליך השתלת הכליה של העכבר.
Abstract
השתלת כליה בעכברים היא הליך ניתוח מסובך ומאתגר. יש מעט מאוד פרסומים המדגימים את השלבים המרכזיים של פעולה זו. לכן, מאמר זה מציג את הטכניקה ומצביע על האזהרות הכירורגיות הקשורות לניתוח זה. בנוסף, מודגמים שינויים חשובים בהשוואה להליך הקונבנציונלי. ראשית, טלאי של אבי העורקים הבטני נחתך ומוכן כך שהביפורקטיונים הפרוקסימליים של עורק הכליה, כולל עורק השופכה עוברים יחד עם הכליה התורמת en bloc. זה מקטין את הסיכון לנמק השופכן ומונע התפתחות של חסימת דרכי השתן. שנית, שיטה חדשה של anastomosis כלי הדם הוא הוכיח המאפשר המפעיל להגדיל באופן גמיש או להקטין את גודל של anastomosis לאחר השתלת הכליה reperfusion כבר יזם. זה מונע את הפיתוח של היצרות כלי הדם ודימום intraabdominal. שלישית, מוצגת טכניקה המאפשרת את הרסטומוזה של השופכן התורם העדין ושל שלפוחית השתן המקבלת שאינה גורמת לטראומה. אימוץ פרוטוקול זה יכול לקצר את זמן הפעולה ולצמצם את הנזק לשלפוחית השתן של הנמען, ובכך להגדיל באופן משמעותי את שיעור ההצלחה של הניתוח עבור העכברים המקבלים.
Introduction
מאז שסקוביץ ואחרים פיתחו מודלים של השתלת כליה בעכברים בשנת 1973 בפעם הראשונה1, הוא הוכיח את עצמו ככלי ניסיוני חשוב לחקר המנגנונים של פגיעה איסכמית בהשתלה ודחייה אלואימונית, כמו גם לפיתוח טיפולים חדשים שמטרתם להאריך את הישרדות האלוגרפט ואולי להשיג סבילות אימונולוגית. עם זאת, הטכניקה הכירורגית הוכחה כמורכבת ותובענית מאוד, לעיתים עם סיבוכים כגון היצרויות אנסטומוטיות של כלי הדם המובילות לאי ספיקת כליה טרום-רנלית שאינה אימונולוגית2, כשל פוסט-פרנאלי הנגרם על ידי איסכמיה ונמק לאחר מכן של השופכן המושתל, היצרויות של האנסטומוזה של השופכן המושתל ו /או שלפוחית השתן של המושתל המובילות להפרעה בזרימת השתן. כל אלה הן סיבות מדוע השתלת כליה בעכברים לא פותחה עוד יותר ולכן אינה בשימוש נרחב. לביסוס מודל השתלת כליה יעיל ויציב לטווח ארוך של עכברים ללא סיבוכים וסקולריים ודרכי שתן עדיין יש משמעות שאין לה תחליף עבור מחקרים רבים בתחום ההשתלות תוך התמקדות במחלות כלייתיות בתיווך חיסוני אך גם זיהומיות3. בנוסף, בהשוואה להשתלות איברים אחרות במודלים של מורין כגון השתלת ריאות, לב ומעיים 4,5, מודל השתלת הכליה של העכבר מציע סיכוי לחקר הישרדות ארוכת טווח גם במסגרת פער אנטיגן היסטו-קומפטבילי גדול 3,6. כמו כן הוכח כי באותה סביבה של שילובי זן תורם-מושתל השתלות איברים שונות כגון לב או כליה מאופיינות בדינמיקה שונה ובהתחלות של דחיית allograft3. יתר על כן, מנקודת מבט נפרולוגית, זהו מודל מתאים יותר לחקר מנגנוני ויסות חיסוני בתיווך פרנכימלי בהקשר של אירועי דחייה חריפים וכרוניים מאשר ניסויים פשוטים בהשתלת עור.
על בסיס דיווחים קודמים על הטכניקה הניתוחית של השתלת כליה בעכברים 3,7,8,9, אנו מדגימים כאן את השיפורים המהימנים הבאים שיושמו בהצלחה במהלך 10 השנים האחרונות בתוך הקבוצה שלנו 10,11,12: ראשית, עורק השופכה נשמר בבטחה כאשר עורק הכליה נחתך באופן גושני יחד עם החלק המתאים של אבי העורקים הבטני. שנית, טכניקה חדשה, פשוטה ומהירה של אנסטומוזה וסקולרית ללא קשרים, שבה התפר הסופי של האנסטומוזיס אינו קשור לקצה העניבה העליונה כמו הגישה המסורתית אלא נשאר חופשי. טכניקה זו מאפשרת להגדיל או להקטין את גודל האנסטומוזיס לאחר ריפרפוזיה כלייתית כדי למנוע היצרות כלי דם ודימום תוך-אבדומינלי. שלישית, מחטי מזרק 21 G ו-30 G שימשו ככלי עזר מנחה לניקוב על מנת להשתיל את השופכן התורם בדופן שלפוחית השתן של המקבל, ובכך להפחית את הנזק לשלפוחית השתן של המקבל ולהקל על היווצרות של אנסטומוזיס ללא היצרות.
בדו”ח זה, השווינו גם את הטכניקה המסורתית, הנמצאת בשימוש נרחב, עם הטכניקה המתוקנת שהוקמה במעבדה שלנו ולא מצאנו הבדל משמעותי במידת ניוון צינוריות הכליה ופיברוזיס של השתלת כליה. במחקרים קודמים, השווינו בנוסף את התוצאות של טכניקה חדשה זו עם השיטה המקובלת במונחים של דימום מקומי, פקקת, זמן לביצוע אנסטומוזיס כלי הדם ושיעור ההישרדות. מצאנו שיפורים כגון הפחתה משמעותית של אירועי פקקת מקומיים (1.1% לעומת 6.6%), זמן מופחת להליך הרסטומוזה, והישרדות ארוכת טווח של השתלת כליות סינגנית הניתנת לשחזור (95% לעומת 84% בגישה הקלאסית)10.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעוד שמודל השתלת העור בעכברים הוא פשוט וקל לביצוע כדי לחקור אירועי דחייה אלואימוניים, הטכניקות הכירורגיות לחקר באופן ספציפי יותר את השינויים הדלקתיים הקשורים לאלואימוניות לאחר לב16 והשתלת כליה10 הוכחו כמורכבת ותובענית מאוד. מנקודת מבטו של הנפרולוג המושתל, להקמת …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לצוות ד”ר טיאנטיאן באי על העזרה בקריינות, מיס מיאן פאו על עזרתה באיור רפואי. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי קרן המחקר הגרמנית (DFG) לקידום שיתופי פעולה בינלאומיים (HO2581/4-1 עד AH) והקרן הלאומית למדע של סין (NSFC; #81760291 ל- FJ).
Materials
| 30G-needles | Braun | 456300 | – |
| acepromazine | CP Pharma | Tranquisol P | – |
| Bepanthen eye ointment | Haus-Apotheke | PZN 01578675 | – |
| Bonn Micro Forceps | FST | 11083-07 | – |
| Box for insulation and oxygen supply device | RUSKINN | INVIV | – |
| C57BL/6J mice | Charles River. Germany | no catalog number | – |
| Carprofen | Zoetis | Rimadyl 50 mg/ml | – |
| CATHETER-FEP 26G | TERUMO | Surflo-W | – |
| Clip Applicator Forceps Style | FST | 18057-14 | – |
| Curved forceps | WPI | 14114-G | – |
| Cutasept skin disinfection | VWR | BODL980365 | – |
| Dehydrator | DIAPATH | Donatello | – |
| electrosurgical pen | Bovie | CHANGE-A-TIP | – |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | – |
| Ethanol | Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD | 100092683 | – |
| Frozen platform | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | – |
| gauze pads, cotton swabs | Lohmann-Rauscher | 13353 | – |
| Glass slide | Servicebio | G6004 | – |
| HE dye solution set | Servicebio | G1003 | – |
| Heating mat | THERMO MAT PRO 30W | HTP-30 | – |
| hemostatic sponge | CuraSpon | J1276A | – |
| heparine-solution | Haus-Apotheke | PZN 03029820 | – |
| ice box | PETZ | No Catalog Number available | – |
| Imaging system | Nikon | Nikon DS-U3 | – |
| Inhalation anesthesia device | GROPPLER | BKGM 0616 | – |
| isoflurane | CP Pharma | Isofluran CP 1 ml/ml | – |
| ketamine | Zoetis | no catalog numer | – |
| Masson dye solution set | Servicebio | G1006 | – |
| metamizole | WDT | no catalog numer | – |
| Micro scissors | FST | 15000-00,15000-10 | – |
| Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm | FST | 18055-06 | – |
| Microscope | Leica | LEICAMZ6 | – |
| Microscope light | SCHOTT | KL2500LED | – |
| Neutral gum | SCRC | 10004160 | – |
| Oven | Tianjin Laibo Rui Instrument Equipment Co., Ltd | GFL-230 | – |
| Pathology slicer | Shanghai Leica Instrument Co., Ltd | RM2016 | – |
| Saline solution (NaCl 0.9 %) | Haus-Apotheke | PZN 06178437 | – |
| scissors | Peha Instruments | 991083/4 | – |
| Slides | Servicebio | – | |
| small Petri dish | Sarstedt | 8,33,900 | – |
| straight forceps | WPI | 14113-G | – |
| surgical tape | BSN | 4120 | – |
| Suture Tying Forceps – 10 cm | FST | 18025-10 | – |
| Sutures(10-0) | Medtronic | N2540 | – |
| Sutures(4-0) | ETHILON | V4940H | – |
| Sutures(7-0) | ETHILON | 1647H | – |
| Syringe (0,3 mL) | BD | 324826 | – |
| Syringe (1 mL) | BD | 320801 | – |
| Tissue spreader | Zhejiang Kehua Instrument Co., Ltd | KD-P | – |
| Upright optical microscope | Nikon | Nikon Eclipse E100 | – |
| xylazine | Bayer | Rompun | – |
| Xylene | Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD | 10023418 | – |
References
- Skoskiewicz, M., Chase, C., Winn, H. J., Russell, P. S. Kidney transplants between mice of graded immunogenetic diversity. Transplantation Proceedings. 5 (1), 721-725 (1973).
- Jiang, K., et al. Noninvasive assessment of renal fibrosis with magnetization transfer MR imaging: Validation and evaluation in murine renal artery stenosis. Radiology. 283 (1), 77-86 (2017).
- Tse, G. H., et al. Mouse kidney transplantation: Models of allograft rejection. Journal of Visualized Experiments. (92), e52163 (2014).
- Okazaki, M., et al. et al.Costimulatory blockade-mediated lung allograft acceptance is abrogated by overexpression of Bcl-2 in the recipient. Transplantation Proceedings. 41 (1), 385-387 (2009).
- Chuck, N. C., et al. et al.Ultra-short echo-time magnetic resonance imaging distinguishes ischemia/reperfusion injury from acute rejection in a mouse lung transplantation model. Transplant International. 29 (1), 108-118 (2016).
- Zhang, Z., et al. Pattern of liver, kidney, heart, and intestine allograft rejection in different mouse strain combinations. Transplantation. 62 (9), 1267-1272 (1996).
- Wang, J., Hockenheimer, S., Bickerstaff, A. A., Hadley, G. A. Murine renal transplantation procedure. Journal of Visualized Experiments. (29), e1150 (2009).
- Plenter, R., Jain, S., Ruller, C. M., Nydam, T. L., Jani, A. H. Murine kidney transplant technique. Journal of Visualized Experiments. (104), e52848 (2015).
- Plenter, R. J., Jain, S., Nydam, T. L., Jani, A. H. Revised arterial anastomosis for improving murine kidney transplant outcomes. Journal of Investigative Surgery. 28 (4), 208-214 (2015).
- Rong, S., Lewis, A. G., Kunter, U., Haller, H., Gueler, F. A knotless technique for kidney transplantation in the mouse. Journal of Transplantation. , 127215 (2012).
- Kreimann, K., et al. Ischemia reperfusion injury triggers CXCL13 release and B-cell recruitment after allogenic kidney transplantation. Frontiers in Immunology. 11, 1204 (2020).
- Schmidbauer, M., et al. Diffusion-Weighted imaging and mapping of T1 and T2 relaxation time for evaluation of chronic renal allograft rejection in a translational mouse model. Journal of Clinical Medicine. 10 (19), 4318 (2021).
- Wu, K., et al. Novel technique for blood circuit reconstruction in mouse heart transplantation model. Microsurgery. 26, 594-598 (2006).
- Haas, M. Chronic allograft nephropathy or interstitial fibrosis and tubular atrophy: what is in a name. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23 (3), 245-250 (2014).
- Dang, Z., MacKinnon, A., Marson, L. P., Sethi, T. Tubular atrophy and interstitial fibrosis after renal transplantation is dependent on galectin-3. Transplantation. 93 (5), 477-484 (2012).
- Yin, D., et al. Blood circuit reconstruction in an abdominal mouse heart transplantation model. Journal of Visualized Experiments. (172), e62007 (2021).
- Zhang, Z., et al. Improved techniques for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 16 (2), 103-109 (1995).
- Mannon, R. B., et al. Chronic rejection of mouse kidney allografts. Kidney International. 55 (5), 1935-1944 (1999).
- Coffman, T., et al. Improved renal function in mouse kidney allografts lacking MHC class I antigens. Journal of Immunology. 151 (1), 425-435 (1993).
- Martins, P. N. Learning curve, surgical results and operative complications for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 26 (8), 590-593 (2006).
